【摘要】：目的:研究川彎嗪體內(nèi)外干預(yù)對血小板活化的影響,并從microRNA(miRNA)及其靶基因和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控探討川芎嗪抑制血小板活化的作用機制,以期進(jìn)一步從miRNA及相關(guān)通路調(diào)控豐富川芎嗪抗血小板活化作用機制,為其臨床抗血小板治療提供實驗依據(jù)。方法:1、體外實驗:血小板經(jīng)不同濃度鹽酸川芎嗪(Ligustrazine Hydrochloride,LH;1、2、3 mM)預(yù)處理后,給予二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP;5.5 μM)刺激,通過比濁法檢測血小板聚集,流式細(xì)胞儀檢測血小板內(nèi)Ca2+含量,酶聯(lián)免疫吸附試驗(EnzymeLinked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測血栓素 B2(Thromboxane B2,TXB2)含量和Western-blot檢測整合素αIIbβ3的表達(dá)及其磷酸化水平;體內(nèi)實驗:Sprague-Dawley(SD)大鼠經(jīng)鹽酸川號嗪預(yù)處理后(80mg/kg/d),通過皮下注射腎上腺素(Adrenaline;1mg/kg)構(gòu)建血小板過度活化大鼠模型,采用剪尾法檢測小鼠出血時間改變,并提取血小板和給予ADP刺激,采用比濁法檢測血小板聚集,流式細(xì)胞儀檢測血小板內(nèi)Ca2+含量,ELISA檢測血清中TXB2和6-酮-前列環(huán)素(6-keto-PGF1α)含量。2、采用Western-blot檢測不同濃度鹽酸川芎嗪(LH;1、2、3 mM)體外干預(yù)對ADP刺激后血小板中AKT、ERK、p38MAPK的表達(dá)及其磷酸化水平和80 mg/kg/d的川芎嗪體內(nèi)干預(yù)對AKT表達(dá)及磷酸化水平的影響;采用AKT通路激活劑胰島素樣生長因子-1(Insulin-like Growth Factor 1,IGF-1;300 mM)誘導(dǎo)血小板,并通過比濁法檢測血小板聚集,流式細(xì)胞儀檢測血小板內(nèi)Ca2+含量和ELISA檢測血清中TXB2含量。3、采用miRNATLDA芯片檢測川芎嗪干預(yù)對SD大鼠血小板中miRNA表達(dá)的影響,通過靶基因預(yù)測和通路(Pathway)分析川芎嗪干預(yù)后被顯著富集的差異表達(dá)miRNA相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并通過Western-blot檢測AKT通路反向調(diào)節(jié)因子PTEN、THEM4和PHLPP等基因在蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果:1、體外實驗:川芎嗪體外干預(yù)顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集,降低血小板中Ca2+含量和血小板上清液中TXB2的含量,降低血小板中整合素αIIbβ3的磷酸化水平;體內(nèi)實驗:川芎嗪預(yù)處理顯著延長血小板過度活化SD模型大鼠出血時間,降低血小板Ca2+含量和血清中TXB2的含量,增加血清中6-keto-PGF1α含量。2、川號嗪干預(yù)顯著抑制ADP誘導(dǎo)后血小板AKT、ERK和p38MAPK的磷酸化水平;川芎嗪干預(yù)顯著降低AKT通路激活劑(IGF-1)誘導(dǎo)后的血小板AKT的磷酸化水平,顯著抑制血小板聚集,降低血小板中Ca2+含量和血小板上清液中TXB2的含量。3、川芎嗪預(yù)處理顯著下調(diào)血小板過度活化模型大鼠血小板中39個miRNA的表達(dá),靶基因預(yù)測和Pathway分析證實PI3K/AKT通路被顯著富集,川號嗪干預(yù)顯著下調(diào)血小板miR-331-3p、miR-34a-5p及上調(diào)二者的共同靶基因、AKT反向調(diào)節(jié)因子PHLPP的表達(dá)。結(jié)論:川彎嗪體內(nèi)外干預(yù)顯著抑制血小板聚集,且通過下調(diào)miR-331-3p、miR-34a-5p等miRNA和上調(diào)PHLPP等靶基因表達(dá),進(jìn)而抑制PI3K/AKT等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是其發(fā)揮抑制血小板活化的重要機制。
【圖文】：

板聚集儀測定各組血小板的聚集率（Ｐｌａｔｅｌｅｔ邋ａｇｇｒｅｇｒａｔｉｏｎ邋Ｒａｔｅ），繪制血小板聚逡逑集曲線和計算最大聚集率（Ｍａｘ邋ｐｌａｔｅｌｅｔ邋ａｇｇｒｅｇｒａｔｉｏｎ）。實驗結(jié)果如圖１－１Ａ所不，逡逑對照組（Ｃｏｎｔｒｏｌ）中血小板聚集率一直維持在０左右，提示血小板未發(fā)生明顯逡逑聚集；ＡＤＰ組的血小板聚集率經(jīng)ＡＤＰ刺激后一直呈上升趨勢，并在１５０邋ｓ后維逡逑持在相對穩(wěn)定水平；而不同濃度的川芎嗪干預(yù)均發(fā)現(xiàn)具有不同程度降低血小板逡逑聚集的作用，且隨著川芎嗪濃度的增高，血小板聚集率升高越緩慢。進(jìn)一步計逡逑算血小板最大聚集率發(fā)現(xiàn)，與對照組相比（－２．９０Ｕ４．４７％），ＡＤＰ誘導(dǎo)可顯著上逡逑升血小板的聚集率（６９．２５±７．４５％；邋Ｖ＜０．０５與對照組相比），而ｌ－３ｍＭ川芎嗪逡逑干預(yù)后血小板聚集率分別為６０．１２±１０．０８％、４７．８３±１１．０５％和１９．５４±２．１２％逡逑（＞＜０．０５，與ＡＤＰ組相比），即川芎嗪干預(yù)能夠顯著降低ＡＤＰ刺激血小板的逡逑最大聚集率�？梢姡ㄜ亨焊深A(yù)具有顯著抑制ＡＤＰ誘導(dǎo)的血小板體外聚集的作逡逑用。逡逑

小板中Ｃａ２＋含量的影響，本研究通過不同濃度川芎嗪預(yù)處理大鼠離體血小板，逡逑并給予ＡＤＰ刺激，采用流式細(xì)胞儀檢測和分析血小板細(xì)胞內(nèi)Ｃａ２＋的含量。實驗逡逑結(jié)果如圖１－２Ａ所示，與對照組相比，ＡＤＰ刺激后，代表血小板內(nèi)Ｃａ２＋的含量逡逑的曲線明顯右移，即ＡＤＰ刺激能夠顯著增加血小板內(nèi)Ｃａ２＋的含量，而不同濃度逡逑川芎嗪干預(yù)后血小板內(nèi)Ｃａ２＋的含量的曲線不同程度左移（與ＡＤＰ組相比），其逡逑中３邋ｍＭ的川芎嗪千預(yù)后Ｃａ２＋的含量的曲線左移最為明顯。進(jìn)一步的平均熒光逡逑強度分析發(fā)現(xiàn)分析如圖１－２Ｂ所示，與對照組相比（１．９２±１．６０），ＡＤＰ干預(yù)能夠逡逑顯著增加血小板內(nèi)Ｃａ２＋的含量（４０．０８±４．４３；邋＃Ｐ＜０．０５），而不同濃度川芎嗪干預(yù)逡逑后血小板內(nèi)Ｃａ２＋的含量分別為３８．４４±６．８８、３０．７７士４．５７邋（＞＜０．０５，與ＡＤＰ組相逡逑比）和２４．１９±５．７９邋（＞＜０．０５，與ＡＤＰ組相比），均不同程度降低血小板內(nèi)Ｃａ２＋逡逑含量。結(jié)果表明川芎嗪干預(yù)具有降低ＡＤＰ誘導(dǎo)的血小板中Ｃａ２＋含量的作用。逡逑Ａ邋§邋邐邋Ｂ逡逑－邋＃逡逑邐ＡＤＰ＋Ｉ邋１１（１邋ｍＭ）邐丁邐丁逡逑＾邐——ＡＤＰ＋Ｉ邋１１（２邋ｍＭ）邐＋４０－邐Ｉ逡逑ｉ邋Ｓ：，—、＂卜＾邐Ｈｉ邋ＢＨ邋Ｔ逡逑＾逡逑＾邐＿Xu＿W逡逑１＞邐＾邐１０２邐１６３邐１０＼ＤＰ（５．５ＵＭ）邐＿邐＋邐＋邐＋邐＋逡逑Ｆｌｕ0－４－Ｃａ邋２＋邐ＬＨ（ｍＭ）邐０邐０邐１２邐３逡逑圖１－２川號嗪干預(yù)對ＡＤＰ誘導(dǎo)的血小板胞漿中Ｃａ２＋含量的影響。逡逑離體大鼠血小板經(jīng)不同濃度川芎嗪處理后
【學(xué)位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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4 宋s

本文編號：2602718