【摘要】：目的:本實驗以集合管細胞(IMCD3細胞系)為研究對象,觀察阿霉素誘導IMCD3細胞損傷后細胞凋亡、AQP2蛋白表達的變化;進一步探討當歸芍藥散對阿霉素誘導IMCD3損傷后cAMP、PKA、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達的變化,初步探討當歸芍藥散對阿霉素誘導IMCD3細胞損傷的作用機制研究。方法:第一部分不同濃度阿霉素對IMCD3細胞誘導損傷的研究1.MTT法檢測不同濃度阿霉素對IMCD3細胞損傷的研究。觀察不同濃度阿霉素作用下,IMCD3細胞生長狀態(tài)的影響。2.倒置顯微鏡觀察,隨著阿霉素濃度變化,IMCD3細胞形態(tài)學的變化。3.Annexin V/PI染色法觀察阿霉素的梯度變化,觀察IMCD3細胞凋亡情況。4.Western blot法檢測隨著阿霉素濃度變化,IMCD3細胞AQP2蛋白表達的影響。MTT法及Annexin V/PI染色分為正常組、1×10~-77 mol/L組、1×10~-88 mol/L組、1×10~(-9)mol/L組、1×10~(-10)mol/L組、1×10~-1111 mol/L組;Western blot法分為正常組、1×10~-88 mol/組、1×10~-99 mol/L組、1×10~(-10)mol/L組、1×10~-1111 mol/L組。第二部分不同濃度當歸芍藥散對阿霉素誘導IMCD3細胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達的作用1.MTT法檢測當歸芍藥散梯度對阿霉素損傷的IMCD3細胞的生長影響。2.Western blot法檢測不同濃度當歸芍藥散對阿霉素誘導損傷的IMCD3細胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達。MTT法實驗分為正常組、模型組、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL、6.4mg/mL、12.8mg/mL;Western blot法實驗分組正常組、模型組、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL.第三部分當歸芍藥散對阿霉素誘導的IMCD3細胞損傷機制的研究1.ELISA法檢測不同濃度當歸芍藥散對阿霉素誘導的IMCD3細胞cAMP含量。2.Na~+-K~+-ATP酶測定盒檢測當歸芍藥散對阿霉素誘導的IMCD3細胞Na~+-K~+-ATP酶活性變化。3.Western blot法檢測不同濃度當歸芍藥散對阿霉素誘導的IMCD3細胞PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP蛋白表達的變化,探討當歸芍藥散對阿霉素誘導IMCD3細胞損傷機制的研究。實驗分為正常組、模型組(阿霉素組)、當歸芍藥散低劑量組(0.2mg/mL)、當歸芍藥散中劑量組(1.6mg/mL)、當歸芍藥散高劑量組(3.2mg/mL)、H-89抑制劑組。結果:第一部分 不同濃度阿霉素對IMCD3細胞AQP2蛋白表達的影響1.MTT法檢測隨著阿霉素梯度稀釋后IMCD3細胞生長狀態(tài)的影響。結果顯示,較正常組比較,阿霉素濃度在1×10~-77 mol/L以上,OD值下降,形態(tài)學觀察可見不同劑量的阿霉素對細胞呈現(xiàn)不同程度的抑制以及死亡,有顯著性差異(P0.01);當其濃度降低為1×10~-99 mol/L、1×10~(-10)mol/L、1×10~-1111 mol/L時,OD值增高(P0.01)。2.Annexin V/PI染色法檢測結果顯示,較正常組比較,阿霉素濃度為1×10~-88 mol/L、1×10~-99 mol/L、1×10~-1010 mol/L、1×10~-1111 mol/L時細胞凋亡率逐漸升高,差異具有顯著性意義(P0.01)。3.Western blot法檢測結果顯示,相比于正常組,阿霉素濃度為1×10~-88 mol/L,AQP2蛋白表達顯著下調(P0.01);阿霉素濃度為1×10~-1010 mol/L、1×10~-1111 mol/L時,AQP2蛋白表達呈現(xiàn)不同程度的升高(P0.01)。Annexin V/PI染色法檢測結果顯示,較正常組比較,阿霉素濃度為1×10~-88 mol/L、1×10~-99 mol/L、1×10~-1010 mol/L、1×10~(-11)mol/L時細胞凋亡率逐漸升高,差異具有顯著性意義(P0.01)。阿霉素的最佳濃度在綜合MTT法、Annexin V/PI染色法、Western blot法實驗結果后定為1×10~(-8)mol/L作為誘導損傷IMCD3的濃度作為最佳濃度以用于后續(xù)實驗。第二部分 不同濃度當歸芍藥散對阿霉素誘導IMCD3細胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達的作用1.MTT法檢測不同濃度當歸芍藥散對阿霉素誘導IMCD3細胞結果顯示,較正常組比較,模型組IMCD3細胞生長增殖無明顯影響(P0.05);較模型組比較,0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml、3.2mg/ml濃度下對IMCD3細胞生長增殖無明顯影響(P0.05),6.4mg/ml、12.8mg/ml對IMCD3細胞生長增殖具有不同程度的抑制作用,差異具有統(tǒng)計學意義。2.Western blot法檢測結果顯示,較正常組比較,模型組AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達顯著降低(P0.01),較模型組比較,隨著當歸芍藥散濃度的提高,AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白的表達均顯著升高,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,其中在1.6mg/mL升高最為明顯(p0.01)。綜合MTT法、Western blot法實驗結果,在后期實驗中采用0.2mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL作為分別作為當歸芍藥散低、中、高劑量組用于實驗。第三部分 當歸芍藥散對阿霉素誘導的IMCD3細胞損傷機制的研究1.Na~+-K~+-ATP酶活性檢測法結果顯示,較正常組比較,模型組Na~+-K~+-ATP酶活性明顯降低(P0.01);較模型組比較,當歸芍藥散各劑量組均能提高Na~+-K~+-ATP酶活性,其中中劑量對Na~+-K~+-ATP酶活性的提高最為明顯。H-89抑制劑組較模型組Na~+-K~+-ATP酶沒有顯著差異。2.ELISA法檢測當歸芍藥散對阿霉素誘導的IMCD3細胞cAMP結果顯示,較空白對照組,模型組cAMP含量顯著降低(P0.05);與模型組比較,當歸芍藥散各劑量cAMP含量組均有不同程度的提高,其中當歸芍藥散中劑量提高的最為明顯,不同H-89抑制劑組較模型組比較cAMP顯著降低(P0.05)。3.Western blot法檢測當歸芍藥散對阿霉素誘導的IMCD3細胞PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達水平,結果顯示:較空白對照組,模型組PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達均顯著降低(P0.01);與模型組比較,當歸芍藥散各劑量組升高了PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,H-89抑制劑組較模型組比較PKA、CREB、AQP2顯著降低(P0.05),對Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達沒有顯著性差異。結論:1.阿霉素能夠細胞凋亡途徑促使IMCD3細胞損傷,可抑制AQP2蛋白的表達。2.當歸芍藥散可提高阿霉素誘導的IMCD3細胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白的表達。當歸芍藥散能提高IMCD3細胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白的表達從而加強細胞水液平衡調節(jié)可能是通過激活cAMP/PKA信號傳導通路實現(xiàn)的。
【圖文】：

1×10-9mol/L 1×10-10mol/L 1×10-11mol/L圖 1-1 不同濃度的阿霉素對 IMCD3 細胞增殖的影響Figure 1-1 Effects of different concentrations ofADR on proliferation of IMCD3 cells.2 MTT 法檢測不同濃度的阿霉素對 IMCD3 細胞的毒性作用

圖 1-2 不同濃度的阿霉素對 IMCD3 細胞 OD 值的影響(濃度單位：moFigure 1-2 Effect of different concentrations ofADR on the OD of IMCD3 注：與正常組比較，，**P<0.01.3 不同濃度阿霉素對 IMCD3 細胞凋亡的影響
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2601739