【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)以集合管細(xì)胞(IMCD3細(xì)胞系)為研究對(duì)象,觀察阿霉素誘導(dǎo)IMCD3細(xì)胞損傷后細(xì)胞凋亡、AQP2蛋白表達(dá)的變化;進(jìn)一步探討當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)IMCD3損傷后cAMP、PKA、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達(dá)的變化,初步探討當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)IMCD3細(xì)胞損傷的作用機(jī)制研究。方法:第一部分不同濃度阿霉素對(duì)IMCD3細(xì)胞誘導(dǎo)損傷的研究1.MTT法檢測(cè)不同濃度阿霉素對(duì)IMCD3細(xì)胞損傷的研究。觀察不同濃度阿霉素作用下,IMCD3細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。2.倒置顯微鏡觀察,隨著阿霉素濃度變化,IMCD3細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。3.Annexin V/PI染色法觀察阿霉素的梯度變化,觀察IMCD3細(xì)胞凋亡情況。4.Western blot法檢測(cè)隨著阿霉素濃度變化,IMCD3細(xì)胞AQP2蛋白表達(dá)的影響。MTT法及Annexin V/PI染色分為正常組、1×10~-77 mol/L組、1×10~-88 mol/L組、1×10~(-9)mol/L組、1×10~(-10)mol/L組、1×10~-1111 mol/L組;Western blot法分為正常組、1×10~-88 mol/組、1×10~-99 mol/L組、1×10~(-10)mol/L組、1×10~-1111 mol/L組。第二部分不同濃度當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)IMCD3細(xì)胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達(dá)的作用1.MTT法檢測(cè)當(dāng)歸芍藥散梯度對(duì)阿霉素?fù)p傷的IMCD3細(xì)胞的生長影響。2.Western blot法檢測(cè)不同濃度當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)損傷的IMCD3細(xì)胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達(dá)。MTT法實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL、6.4mg/mL、12.8mg/mL;Western blot法實(shí)驗(yàn)分組正常組、模型組、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL.第三部分當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的IMCD3細(xì)胞損傷機(jī)制的研究1.ELISA法檢測(cè)不同濃度當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的IMCD3細(xì)胞cAMP含量。2.Na~+-K~+-ATP酶測(cè)定盒檢測(cè)當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的IMCD3細(xì)胞Na~+-K~+-ATP酶活性變化。3.Western blot法檢測(cè)不同濃度當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的IMCD3細(xì)胞PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP蛋白表達(dá)的變化,探討當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)IMCD3細(xì)胞損傷機(jī)制的研究。實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組(阿霉素組)、當(dāng)歸芍藥散低劑量組(0.2mg/mL)、當(dāng)歸芍藥散中劑量組(1.6mg/mL)、當(dāng)歸芍藥散高劑量組(3.2mg/mL)、H-89抑制劑組。結(jié)果:第一部分 不同濃度阿霉素對(duì)IMCD3細(xì)胞AQP2蛋白表達(dá)的影響1.MTT法檢測(cè)隨著阿霉素梯度稀釋后IMCD3細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示,較正常組比較,阿霉素濃度在1×10~-77 mol/L以上,OD值下降,形態(tài)學(xué)觀察可見不同劑量的阿霉素對(duì)細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的抑制以及死亡,有顯著性差異(P0.01);當(dāng)其濃度降低為1×10~-99 mol/L、1×10~(-10)mol/L、1×10~-1111 mol/L時(shí),OD值增高(P0.01)。2.Annexin V/PI染色法檢測(cè)結(jié)果顯示,較正常組比較,阿霉素濃度為1×10~-88 mol/L、1×10~-99 mol/L、1×10~-1010 mol/L、1×10~-1111 mol/L時(shí)細(xì)胞凋亡率逐漸升高,差異具有顯著性意義(P0.01)。3.Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于正常組,阿霉素濃度為1×10~-88 mol/L,AQP2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01);阿霉素濃度為1×10~-1010 mol/L、1×10~-1111 mol/L時(shí),AQP2蛋白表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的升高(P0.01)。Annexin V/PI染色法檢測(cè)結(jié)果顯示,較正常組比較,阿霉素濃度為1×10~-88 mol/L、1×10~-99 mol/L、1×10~-1010 mol/L、1×10~(-11)mol/L時(shí)細(xì)胞凋亡率逐漸升高,差異具有顯著性意義(P0.01)。阿霉素的最佳濃度在綜合MTT法、Annexin V/PI染色法、Western blot法實(shí)驗(yàn)結(jié)果后定為1×10~(-8)mol/L作為誘導(dǎo)損傷IMCD3的濃度作為最佳濃度以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第二部分 不同濃度當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)IMCD3細(xì)胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達(dá)的作用1.MTT法檢測(cè)不同濃度當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)IMCD3細(xì)胞結(jié)果顯示,較正常組比較,模型組IMCD3細(xì)胞生長增殖無明顯影響(P0.05);較模型組比較,0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml、3.2mg/ml濃度下對(duì)IMCD3細(xì)胞生長增殖無明顯影響(P0.05),6.4mg/ml、12.8mg/ml對(duì)IMCD3細(xì)胞生長增殖具有不同程度的抑制作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,較正常組比較,模型組AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達(dá)顯著降低(P0.01),較模型組比較,隨著當(dāng)歸芍藥散濃度的提高,AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白的表達(dá)均顯著升高,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,其中在1.6mg/mL升高最為明顯(p0.01)。綜合MTT法、Western blot法實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在后期實(shí)驗(yàn)中采用0.2mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL作為分別作為當(dāng)歸芍藥散低、中、高劑量組用于實(shí)驗(yàn)。第三部分 當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的IMCD3細(xì)胞損傷機(jī)制的研究1.Na~+-K~+-ATP酶活性檢測(cè)法結(jié)果顯示,較正常組比較,模型組Na~+-K~+-ATP酶活性明顯降低(P0.01);較模型組比較,當(dāng)歸芍藥散各劑量組均能提高Na~+-K~+-ATP酶活性,其中中劑量對(duì)Na~+-K~+-ATP酶活性的提高最為明顯。H-89抑制劑組較模型組Na~+-K~+-ATP酶沒有顯著差異。2.ELISA法檢測(cè)當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的IMCD3細(xì)胞cAMP結(jié)果顯示,較空白對(duì)照組,模型組cAMP含量顯著降低(P0.05);與模型組比較,當(dāng)歸芍藥散各劑量cAMP含量組均有不同程度的提高,其中當(dāng)歸芍藥散中劑量提高的最為明顯,不同H-89抑制劑組較模型組比較cAMP顯著降低(P0.05)。3.Western blot法檢測(cè)當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的IMCD3細(xì)胞PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示:較空白對(duì)照組,模型組PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達(dá)均顯著降低(P0.01);與模型組比較,當(dāng)歸芍藥散各劑量組升高了PKA、CREB、AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達(dá),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,H-89抑制劑組較模型組比較PKA、CREB、AQP2顯著降低(P0.05),對(duì)Na~+-K~+-ATP酶蛋白表達(dá)沒有顯著性差異。結(jié)論:1.阿霉素能夠細(xì)胞凋亡途徑促使IMCD3細(xì)胞損傷,可抑制AQP2蛋白的表達(dá)。2.當(dāng)歸芍藥散可提高阿霉素誘導(dǎo)的IMCD3細(xì)胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白的表達(dá)。當(dāng)歸芍藥散能提高IMCD3細(xì)胞AQP2、Na~+-K~+-ATP酶蛋白的表達(dá)從而加強(qiáng)細(xì)胞水液平衡調(diào)節(jié)可能是通過激活cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

1×10-9mol/L 1×10-10mol/L 1×10-11mol/L圖 1-1 不同濃度的阿霉素對(duì) IMCD3 細(xì)胞增殖的影響Figure 1-1 Effects of different concentrations ofADR on proliferation of IMCD3 cells.2 MTT 法檢測(cè)不同濃度的阿霉素對(duì) IMCD3 細(xì)胞的毒性作用

圖 1-2 不同濃度的阿霉素對(duì) IMCD3 細(xì)胞 OD 值的影響(濃度單位：moFigure 1-2 Effect of different concentrations ofADR on the OD of IMCD3 注：與正常組比較，，**P<0.01.3 不同濃度阿霉素對(duì) IMCD3 細(xì)胞凋亡的影響
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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1 張宇;張?zhí)煺?仲維娜;秦曼;;當(dāng)歸芍藥散加減配合激素治療小兒腎病綜合征水腫脾虛濕盛型60例療效臨床觀察[J];黑龍江中醫(yī)藥;2015年05期

2 黃智超;楊芳艷;;當(dāng)歸芍藥散近10年研究綜述[J];遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2015年08期

3 潘永福;許釩;王成業(yè);宣自華;岳曉莉;王運(yùn)來;姚瑤;;基于水通道蛋白研究當(dāng)歸芍藥散對(duì)肝硬化腹水大鼠的干預(yù)作用[J];中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2015年08期

4 石聰穎;韋袞政;王現(xiàn);周立華;;中醫(yī)臟腑水液代謝功能失調(diào)與水通道蛋白2關(guān)系的研究概述[J];環(huán)球中醫(yī)藥;2015年02期

5 伍小燕;陳朝;張國偉;;澤瀉水提物對(duì)正常大鼠利尿活性及腎臟髓質(zhì)AQP2作用研究[J];實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志;2010年21期

6 王德山;王哲;太史春;王道平;;消酐散對(duì)腎氣虛模型大鼠腎組織AQP2表達(dá)的影響[J];中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2010年01期

7 李新建,劉曉城;小鼠進(jìn)展性腎病模型建立的探討及相關(guān)研究[J];山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2005年02期

8 劉少軍,顧勇,蔣殷睿,林善錟;黃芪對(duì)腎病綜合征大鼠腎臟水通道蛋白的影響[J];中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2004年11期

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1 梁星;溫陽化飲和溫陽利水對(duì)腎病綜合征水通道蛋白影響的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2014年

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2 李巖;苓甘五味姜辛湯對(duì)寒飲伏肺型哮喘大鼠cAMP-PKA通路相關(guān)分子表達(dá)的影響[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué);2016年

3 岳曉莉;基于AVP-V2R-AQP2通路研究當(dāng)歸芍藥散治療腎病綜合征的作用及其機(jī)制[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

4 王桃霞;蛋白激酶C-α對(duì)內(nèi)髓集合管上皮細(xì)胞系mIMCD3骨架actin的影響[D];華中科技大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2601739