【摘要】：表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells,EpSCs)在表皮再生、皮膚穩(wěn)態(tài)維持和創(chuàng)面修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。表皮干細(xì)胞具有自我更新能力和增殖潛能,是制備組織工程皮膚理想的種子細(xì)胞。尋找能促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的化合物將有利于為皮膚組織的體外制備提供更多的種子細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道木犀草苷(Luteolin-7-glucoside,L7G)能通過抗炎、抗氧化、抑制透明質(zhì)酸酶和膠原酶活性促進(jìn)皮膚傷口愈合。目的探討L7G是否能促進(jìn)人表皮干細(xì)胞增殖并闡明其作用機(jī)制。方法1.利用中性蛋白酶和胰蛋白酶依次消化人皮膚組織制備表皮細(xì)胞懸液,通過Ⅳ型膠原快速貼壁法分離表皮干細(xì)胞。通過免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)表皮干細(xì)胞標(biāo)志分子(CK19、β1整合素、α6整合素、CD71)以鑒定表皮干細(xì)胞。2.分別通過MTT、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和Ki67免疫熒光染色檢測(cè)L7G對(duì)表皮干細(xì)胞增殖的影響。用碘化丙啶標(biāo)記DNA后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)L7G對(duì)表皮干細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響。通過體外劃痕愈合模型觀察L7G對(duì)表皮干細(xì)胞遷移的影響。3.通過RT-PCR和Western blot檢測(cè)干細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。4.通過HE染色、免疫組化和免疫熒光染色表皮干細(xì)胞標(biāo)志分子分別觀察L7G對(duì)體外培養(yǎng)皮膚組織表皮層厚度以及表皮干細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果1.分離培養(yǎng)的人皮膚表皮干細(xì)胞在光鏡下呈鵝卵石樣。免疫熒光檢測(cè)顯示這些細(xì)胞中CK19及β1整合素陽(yáng)性的細(xì)胞占90%以上;流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明α6整合素高表達(dá)/CD71低表達(dá)的細(xì)胞占92.87%,說明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為表皮干細(xì)胞并且純度較高,并滿足實(shí)驗(yàn)要求。2.通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.1-1 μM的L7G能夠濃度依賴性地促進(jìn)表皮干細(xì)胞增殖。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和Ki67免疫熒光染色結(jié)果證實(shí)L7G能促進(jìn)表皮干細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)L7G孵育表皮干細(xì)胞細(xì)胞能降低G1期細(xì)胞百分比、升高S期細(xì)胞百分比。1 μM的L7G能顯著促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移及劃痕愈合。3.機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)L7G能顯著誘導(dǎo)β-catenin,c-Myc以及細(xì)胞周期蛋白D1、A2、E1的表達(dá);L7G通過β-catenin和c-Myc介導(dǎo)促進(jìn)表皮干細(xì)胞增殖。4.用L7G體外孵育人皮膚組織能顯著增加表皮層的厚度,并增加表皮基底層的α6整合素陽(yáng)性和β1整合素陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。此外,p63以及細(xì)胞增殖抗原在表皮層細(xì)胞的表達(dá)都顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果說明L7G對(duì)離體培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞及皮膚組織中的表皮干細(xì)胞都有促增殖作用。結(jié)論L7G通過上調(diào)β-catenin,c-Myc和細(xì)胞周期蛋白D1,A2和E1的表達(dá)促進(jìn)體外培養(yǎng)的皮膚表皮干細(xì)胞增殖。L7G能促進(jìn)培養(yǎng)的人皮膚組織表皮干細(xì)胞增殖,增加表皮層厚度。
【圖文】：

３．１．２人皮膚表皮干細(xì)胞鑒定逡逑取培養(yǎng)的第２代表皮干細(xì)胞，通過免疫熒光染色檢測(cè)表皮干細(xì)胞標(biāo)志分子（Ｊ１整合素和逡逑ＣＫ！９的表達(dá)。由圖２可見，（３１整合素、ＣＫ１９呈陽(yáng)性的細(xì)胞占９０％以上。逡逑Ｐ１邋Ｉｎｔｅｇｒｉｎ邐ＤＡＰＳ邐Ｍｅｒｇｅ逡逑■■■逡逑ＣＫ１９邐ＤＡＰＩ邐Ｍｅｒｇｅ逡逑圖２，免疫熒光染色檢測(cè)表皮干細(xì)胞ＰＩ整合素和ＣＫ１９表達(dá)（Ｘ邋１００，標(biāo)尺為１００ｐｍ）逡逑

２１逡逑進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)表皮干細(xì)胞標(biāo)志分子整合素ａ６和ＣＤ７１在培養(yǎng)的第２代表逡逑皮干細(xì)胞的表達(dá)情況。由圖３可見整合素ａ６高表達(dá)、同時(shí)ＣＤ７１低表達(dá)的細(xì)胞占９２．８７％。逡逑這些結(jié)果表明我們分離培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞純度較高，滿足實(shí)驗(yàn)要求。逡逑１邋０＾１邋３１邐Ｂ２逡逑１０３１逡逑Ｔ—逡逑卜逡逑Ｑ邋２逡逑0邋１０２１逡逑：邐栜．逡逑１0１ｌ＾邐Ｍ邋＇■邐？逡逑９２．８７。／＜逡逑１０１邋１０２邋１０３邋１０４逡逑ａ６邋ｉｎｔｅｇｒｉｎ逡逑圖３．流式細(xì)胞儀器檢測(cè)表皮干細(xì)胞ｕ６整合素和ＣＤ７１表達(dá)逡逑３．邋２邋Ｌ７Ｇ促進(jìn)表皮干細(xì)胞增殖和遷移逡逑首先通過ＭＴＴ法檢測(cè)Ｌ７Ｇ對(duì)表皮干細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，０．１－２逡逑Ｌ７Ｇ在培養(yǎng)表皮干細(xì)胞２４邋ｈ后能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，在培養(yǎng)４８邋ｈ后促增殖作用更明顯逡逑（圖４八）。丨０＂的Ｌ７Ｇ處理表皮干細(xì)胞Ｉ？４邋ｄ，，細(xì)胞增殖與對(duì)照組相比均有顯著差異（圖４Ｂ）。逡逑這些結(jié)果表明Ｌ７Ｇ能濃度依賴性和時(shí)間依賴性的促進(jìn)表皮干細(xì)胞增殖。然后進(jìn)一步通過逡逑ＢｒｄＵ摻入實(shí)驗(yàn)證實(shí)ｌ邋｜ａＭ的Ｌ７Ｇ能夠促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖（圖４Ｃ）。免疫熒光染色檢測(cè)逡逑細(xì)胞增殖的標(biāo)志分子Ｋｉ６７，發(fā)現(xiàn)Ｉ卜ｉＭ的Ｌ７Ｇ孵育表皮干細(xì)胞２４邋ｈ能顯著增加Ｋｉ６７陽(yáng)性逡逑細(xì)胞數(shù)（圖４Ｄ），也證實(shí)了邋Ｌ７Ｇ對(duì)表皮干細(xì)胞具有促增殖作用。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)Ｌ７Ｇ逡逑處理表皮干細(xì)胞能顯著降低Ｇｌ期細(xì)胞比例、升高Ｓ期細(xì)胞的比例（圖４Ｅ），說明Ｌ７Ｇ通逡逑過促進(jìn)Ｇｌ期向Ｓ期轉(zhuǎn)換而促進(jìn)表皮干細(xì)胞增殖。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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4 袁德品;牛扶幼;王喜梅;喬曉俊;李永濤;;表皮干細(xì)胞及其與糖尿病創(chuàng)面修復(fù)研究[J];糖尿病天地(臨床);2010年05期

5 孫曉艷;付小兵;;表皮干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];感染.炎癥.修復(fù);2008年01期

6 田田;李英春;;胚胎干細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];組織工程與重建外科雜志;2008年04期

7 廣e

本文編號(hào)：2601668