發(fā)布時(shí)間：2020-03-26 11:01

【摘要】：當(dāng)歸(Angelica sinensis),一種多年生草本植物,在中國(guó)分布廣泛,是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材,國(guó)內(nèi)外研究已表明當(dāng)歸具有活血補(bǔ)血、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性,其臨床應(yīng)用價(jià)值極高。植物中的內(nèi)生真菌分布廣、種類(lèi)多,許多藥用植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物具有很高的生物活性,胞外多糖是由微生物細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到培養(yǎng)基中的一種多糖,研究當(dāng)歸內(nèi)生真菌胞外多糖的基本特性將對(duì)當(dāng)歸在醫(yī)藥業(yè)的應(yīng)用提供一定的依據(jù)。本文從當(dāng)歸中分離得到內(nèi)生真菌,采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了當(dāng)歸內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基組分,用響應(yīng)面法優(yōu)化了當(dāng)歸內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件,對(duì)當(dāng)歸內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖進(jìn)行了分離純化,并研究了其抗氧化活性。主要研究結(jié)果如下:1.從當(dāng)歸的根中分離得到了內(nèi)生真菌F1,從菌落形態(tài)、顯微特征和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)構(gòu)等方面分析,最終鑒定其為鏈格孢屬內(nèi)生真菌(Alternaria.tenuissima)。2.采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)的方法,以胞外多糖產(chǎn)量為指標(biāo),優(yōu)化了當(dāng)歸鏈格孢屬F1內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基組分。結(jié)果顯示,各因素對(duì)當(dāng)歸鏈格孢屬F1內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖含量的影響程度依次為:甘露糖酵母提取物鎂離子VC。優(yōu)化得到了當(dāng)歸內(nèi)生真菌超胞外多糖的最佳培養(yǎng)基配方:甘露糖8%、酵母提取物2%、鎂離子0.04%、VC 0.005%。在優(yōu)化的培養(yǎng)基配方下,胞外多糖平均含量為2.5657mg/mL,接近于預(yù)測(cè)值,表明優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)基配方有效可行。3.采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)的方法,以胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值,優(yōu)化了當(dāng)歸內(nèi)生真菌鏈格孢屬F1產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件。結(jié)果表明,各因素對(duì)當(dāng)歸內(nèi)生真菌鏈格孢屬F1產(chǎn)胞外多糖含量的影響程度依次為:發(fā)酵溫度pH接種量發(fā)酵時(shí)間。優(yōu)化得到的當(dāng)歸內(nèi)生真菌產(chǎn)胞外多糖的最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間5天,初始pH=7,接種量3%。在此優(yōu)化條件下,胞外多糖產(chǎn)量為3.32mg/mL,該值與預(yù)測(cè)值接近,表明該優(yōu)化發(fā)酵工藝合理、可行。4.對(duì)當(dāng)歸內(nèi)生真菌鏈格孢屬F1產(chǎn)胞外多糖進(jìn)行了分離純化,并測(cè)定了其胞外多糖的基本特性。用DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-100凝膠柱層析法對(duì)胞外多糖進(jìn)行純化,純化后的胞外多糖為非還原糖,呈黃色粉末,室溫下能溶于水,不溶于乙醇,不含淀粉。用高效液相色譜聯(lián)用多角度激光散射(HPSEC-MALLS)測(cè)得胞外多糖的重均分子量(Mw)和數(shù)均分子量(Mn)分別為為3.246×104 g/mol和2.012×104 g/mol。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)得純化后的胞外多糖主要由5種不同的單糖組成,分別為D-半乳糖醛酸、鼠李糖、D-甘露糖、葡萄糖和D-半乳糖。紅外光譜(FT-IR)掃描結(jié)果顯示該胞外多糖是一種具有吡喃糖分析結(jié)構(gòu)的糖蛋白。掃描電鏡(SEM)結(jié)果顯示,該胞外多糖表面粗糙,呈現(xiàn)多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。熱重分析和差式掃描量熱分析(TGA/DSC)結(jié)果顯示,該胞外多糖熱穩(wěn)定性好,AH=51.92 J/g。5.抗氧化活性測(cè)定結(jié)果顯示,當(dāng)歸內(nèi)生真菌鏈格孢屬F1產(chǎn)胞外多糖具有很強(qiáng)的羥自由基清除活性、超氧陰離子清除活性和還原力,抗氧化活性較強(qiáng)。
【圖文】：

２．３．２當(dāng)歸內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果逡逑從當(dāng)歸的根中分離得到了標(biāo)記為Ｆ１的內(nèi)生真菌，通過(guò)觀察菌落、菌絲和分逡逑生孢子基本特征可以識(shí)別其形態(tài)類(lèi)型。內(nèi)生真菌Ｆ１的菌落特征見(jiàn)圖２－１Ａ。菌株逡逑Ｆ１的早期菌落呈白色、粘稠狀，然后其菌落逐漸聚集到中心，顏色變深，呈橄欖逡逑綠、近圓形、褶皺狀，邊緣整齊。內(nèi)生真菌Ｆ１的微觀顯微特征描述見(jiàn)２－１Ｂ。菌逡逑株Ｆ１具有酵母樣細(xì)胞和菌絲形態(tài)，分生孢子大量產(chǎn)生，且頂端有很短的次生分逡逑生孢子團(tuán)。結(jié)合以上結(jié)論，Ｆ１菌株的所有表形即微觀特征都與鏈格孢屬（．逡逑的十分相似，故初步鑒定其為鏈格孢屬內(nèi)生真菌。逡逑分子生物學(xué)鑒定結(jié)果見(jiàn)圖１Ｃ。通過(guò)基于測(cè)序結(jié)果將Ｆ１的ＩＴＳ序列在ＮＣＢＩ數(shù)逡逑據(jù)庫(kù)中進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對(duì)后，收集同源性比較高的比對(duì)序列，通過(guò)鄰接法構(gòu)建系逡逑統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明Ｆ１與鏈格孢屬（Ａ／ｔｅｒｗａｒｆａ．邐的親緣關(guān)系最近（同逡逑１０逡逑

碳源邐破源濃度逡逑圖３．２碳源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響（Ａ，碳源；Ｂ；甘露糖濃度）逡逑Ｐｉｇ．邋３．２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃａｒｂｏｎ邋ｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｎ邋ＥＰＳ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑菌株生長(zhǎng)過(guò)程中，碳源是為菌株提高碳素來(lái)源的物質(zhì)，同時(shí)，碳也是構(gòu)成細(xì)逡逑胞成分的主要物質(zhì)［５６］。一般來(lái)說(shuō)，，糖類(lèi)是菌株生長(zhǎng)良好的碳源和能源物質(zhì)，但不逡逑＇同菌株對(duì)不同糖類(lèi)物質(zhì)的的吸收利用也是千差萬(wàn)別。逡逑不同碳源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖３．２Ａ�？梢钥闯�，ＩＩ歸鏈格孢屬Ｆ１內(nèi)逡逑生真菌可利用多種碳源發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖，各糖類(lèi)物質(zhì)作為為碳源時(shí)，按多糖含逡逑量從氋到低的排列順序?yàn)椋焊事短�、木糖、葡萄糖和半乳糖。結(jié)果表明，甘露糖逡逑作為碳源時(shí)，有利于當(dāng)歸鏈格孢屬Ｆ１內(nèi)生真菌的利用和多糖積累。故確定最佳逡逑碳源為甘露糖。逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：蘭州理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TQ920.6;R284

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本文編號(hào)：2601351