【摘要】：研究背景及目的:多發(fā)性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)是血液系統(tǒng)中第二常見的惡性腫瘤。近年來新型診療技術(shù)不斷的發(fā)展及應(yīng)用,雖然明顯地改善了患者的生存及預(yù)后,但許多患者仍對現(xiàn)有治療的療效欠佳,疾病復(fù)發(fā)是該病最終的普遍特征。白樺脂酸(Betulinic acid,BA)作為一種天然中藥成分,在許多實體性腫瘤中展現(xiàn)出高效的抗癌活性,其作用于對血液系統(tǒng)腫瘤卻鮮有報道。本文主要目的在于研究BA對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞毒性及生長抑制作用。同時,通過體內(nèi)外實驗,深入挖掘BA可能的分子靶點、信號通路及調(diào)控機制。研究方法:不同濃度的BA處理MM細(xì)胞不同時間后,采用CCK-8法檢測MM細(xì)胞(U266和RPMI 8226)增殖活性。采用EdU增殖實驗再次驗證不同濃度的BA對MM細(xì)胞增殖的影響。用Hoechst 33342染色法檢測不同濃度BA處理后細(xì)胞核形態(tài)變化。用Annexin V/PI流式雙染法檢測MM細(xì)胞的凋亡率。用不同的熒光標(biāo)記探針PI、JC-1、DCFH-DA標(biāo)記U266細(xì)胞,分別檢測細(xì)胞周期、線粒體膜電位(MMP)、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。采用蛋白免疫印跡法(western blot)分別檢測細(xì)胞周期、線粒體凋亡及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。通過免疫熒光染色法測定BA處理前后U266細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65蛋白的表達(dá)及定位。最后,建立裸鼠移植瘤模型,實驗分為對照組(溶劑組/DMSO)和實驗組(BA藥物處理)。剝離對照組和實驗組中裸鼠移植瘤后,通過免疫組化檢測移植瘤中NF-κB p65及Ki-67表達(dá)差異。用western blot檢測移植瘤組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)。研究結(jié)果:CCK-8實驗結(jié)果表明BA可濃度和時間依賴性地抑制U266和RPMI 8226細(xì)胞活性。EdU增殖實驗也證實BA處理后MM細(xì)胞的增殖明顯較對照組明顯降低。流式Annexin V/PI凋亡及細(xì)胞周期染色結(jié)果表明,BA時間和濃度依賴性地促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞凋亡,并可將U266細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期S期。JC-1實驗表明BA可誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位發(fā)生去極化改變。ROS流式結(jié)果表明,BA可濃度依賴地增加U266細(xì)胞內(nèi)ROS水平,并激活細(xì)胞線粒體凋亡通路�？寡趸瘎㎞-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)作為活性氧ROS的清除劑,與BA聯(lián)合使用后,通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,可部分逆轉(zhuǎn)BA引起的ROS依賴性地細(xì)胞壞死。通過western blot檢測NF-κB通路,發(fā)現(xiàn)BA呈濃度依賴性和時間依賴性地對U266細(xì)胞中NF-κB通路產(chǎn)生抑制效應(yīng)。隨后,應(yīng)用NF-κB信號通路特異性的激活劑(TNF-α)和阻滯劑(BAY 11-7082),通過改變NF-κB通路活性,發(fā)現(xiàn)U266細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性與ROS水平呈負(fù)相關(guān),即BA通過抑制NF-κB通路,上調(diào)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過度氧化應(yīng)激壓力導(dǎo)致MM細(xì)胞死亡。最后,在活體動物實驗中,BA同樣可以通過抑制NF-κB信號通路而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。結(jié)論:本研究首次通過體內(nèi)外實驗,研究BA在血液腫瘤MM中的抗癌效應(yīng),并研究其發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子及信號通路。最后,闡明信號通路(NF-κB)與關(guān)鍵分子(ROS)之間的調(diào)控關(guān)系。本研究主要結(jié)論如下:1、BA誘導(dǎo)MM細(xì)胞死亡主要是通過激活線粒體凋亡、周期阻滯、MMP去極化改變、ROS氧化應(yīng)激壓力及NF-κB信號通路阻滯等機制發(fā)揮作用。2、BA通過抑制MM細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路,增加ROS表達(dá)水平,誘導(dǎo)MM處于過度氧化應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞死亡。3、在裸鼠移植瘤模型中,BA也可以通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗MM效應(yīng)。4、BA作為一種高效、具有巨大臨床應(yīng)用潛能的天然抗腫瘤中藥單體,為治療多發(fā)性骨髓瘤的提供新的思路和選擇。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2600929