【摘要】：研究目的:心肌梗死(MI)后心肌重塑的程度影響疾病的預后。自噬已被證明是心臟的一種適應性反應,但作為一種臨床有效復方藥物——益氣活血藥,在MI后的作用仍不清楚,因此我們對益氣活血藥是否通過自噬減輕MI后心肌重塑進行研究。本實驗采用經典的左冠狀動脈前降支結扎法建立大鼠缺血型心肌損傷模型——心梗模型;通過研究臨床經驗有效方——益氣活血藥,在MI后7天和28天對心肌自噬改變的情況,探討益氣活血藥對損傷心肌的保護作用。其著重點在于心肌自噬的改變,實驗過程中使用自噬抑制劑氯喹(CQ)觀察自噬流的變化,最終觀察益氣活血藥通過自噬流改變在心室重塑方面的作用以及相關機制的研究。研究方法:益氣活血藥在MI后第二天通過灌胃進行治療。觀察MI術后7天和28天后大鼠情況,同時使用自噬抑制劑CQ對自噬流進行觀察。為了觀察心室重塑和自噬在MI后術后7天和術后28天的發(fā)展,我們對冠狀動脈結扎術后的心臟進行了分析。手術后24小時內存活的動物通過心電圖隨機分配給兩個觀察時間點:假手術組(S),模型組(M),益氣活血藥組(Y),培哚普利組(P),模型聯(lián)合氯喹組(M+CQ),益氣活血藥聯(lián)合氯喹組(Y+CQ),培哚普利聯(lián)合氯喹(P+CQ)。CQ被認為通過提高溶酶體酸堿度從而抑制溶酶體細胞活性,由于自噬-溶酶體具有酸堿依賴性,堿化對溶酶體的影響是抑制融合和水解活性,從而防止自噬體清除。具體方法如下:(1)復制心肌梗死大鼠模型,運用心電圖確定建模成功;(2)通過超聲心動改變來評價心臟功能變化;(3)通過HE染色和Masson's染色,從組織形態(tài)學上觀察梗死情況和心肌纖維化程度;同時通過檢測心肌細胞肥大標志物ANP判斷心肌肥大的影響。結合超聲心動,從梗死大小、心肌肥大、心肌纖維化三方面綜合判斷益氣活血藥對心室重塑的改變情況;(4)運用臨床較為適用的自噬抑制劑——氯喹(Chloroquine,CQ),進行動物心肌梗死后自噬觀察的研究;檢測自噬流相關蛋白Beclin1、p62、LC3,了解自噬動態(tài)過程的整體改變;運用透射電鏡觀察自噬情況,包括自噬體、線粒體、溶酶體以及整體情況,并通過自噬體計數(shù)來推測自噬活性程度。綜合考慮,益氣活血藥對自噬流的影響;(5)運用免疫印跡法,觀察自噬標記蛋白LC3、自噬-溶酶體相關蛋白CathepsinD的蛋白表達情況,了解自噬活性和降解情況;同時檢測U ·biquitin,以判斷泛素-蛋白酶體系的活性情況,了解蛋白降解整體情況。綜合判斷益氣活血藥在心梗后對蛋白降解的影響;(6)檢測mTOR和4EBP1蛋白及磷酸化表達情況,判斷益氣活血藥對mTOR途徑的影響,揭示對心室重塑可能的機制;(7)以中醫(yī)氣血理論為指導,通過評價自噬情況與心臟結構、功能等變化的關系,進行綜合分析,進一步探索心氣和/或心氣虛相關理論基礎。研究結果:益氣活血藥治療減輕MI后重塑,在MI術后7天上調自噬相關蛋白,并加速自噬的更新,在MI術后28天改善左心功能,使得心室重塑向良性方向發(fā)展。本實驗各組干預在術后7天和術后28天,所有心梗模型術后大鼠的左心室收縮功能和舒張功能均降低,藥物治療組(包括Y、P、Y+CQ和P+CQ組)于術后28天各項指標較術后7天均有緩解,說明藥物治療具有改善心臟功能的功效。,本實驗心臟射血分數(shù)(EF)、收縮期內徑(LVIDs)和收縮期心室容積(LVESV)在術后28天組間可見顯著性差異(P0.05),藥物治療各組(包括Y、P、Y+CQ和P+CQ組)對心臟功能均有改善,其中非抑制劑干預治療組(包括Y、P組)效果最佳,而抑制劑干預治療組(包括Y+CQ和P+CQ組)治療效果略優(yōu)于非治療模型組,推測在疾病早期使用自噬抑制劑CQ對心臟功能有一定遠期影響。檢測心肌梗死邊緣區(qū)組織ANP蛋白和基因表達,其中各組較S組均有統(tǒng)計學差異(P0.05),各藥物干預組(包括Y、P、Y+CQ和P+CQ組)較之非藥物干預模型組(包括M組和M+CQ組)表達降低。益氣活血藥對減輕MI后28天心肌肥大具有突出療效。ANP蛋白和基因表達在各時期均上調,但術后7天較術后28天高,隨著病程進展和治療時間的推移而降低,心肌細胞隨著病程進展則逐漸增大,而藥物治療具有抑制心肌細胞肥大的效果,其中益氣活血藥組抑制心肌細胞肥大具有突出療效(P0.05)。非藥物治療的模型組(M組和M+CQ組)在MI術后7天和28天心肌細胞內自噬體數(shù)量增加,與S組對比具有統(tǒng)計學差異(P0.05),以術后7天最為顯著;各藥物治療組(包括Y、P、Y+CQ和P+CQ組)在兩個觀察時間點與非藥物治療模型組相比,具有統(tǒng)計學差異(P0.05),但術后28天與S組相當,無統(tǒng)計學差異。從自噬體數(shù)量可見抑制劑CQ在術后7天確有抑制作用,主要抑制自噬體崩解,但不影響自噬體生成。行MI手術的大鼠心臟梗死邊緣區(qū),自噬體數(shù)量均增多,而非藥物治療的模型組(無論是否使用自噬抑制劑)的自噬體不僅數(shù)量上增多,且同一視野下可見自噬體多種形態(tài)(包含初始自噬體AVi和終末自噬體AVd)。推測藥物治療組不僅能上調自噬,同時能加速自噬更新。本實驗中,所有行手術的大鼠(包括S組在內),在心肌受損后,自噬均被“啟動”,術后7天,各組大鼠Beclin-1表達均上升,其中自噬抑制劑干預組(包括M+CQ、Y+CQ、P+CQ組)表達遠高于未用抑制劑干預組,具有統(tǒng)計學差異(P0.05);術后28天,抑制劑干預各組趨于基礎水平,與S組無異,而非抑制劑干預組中,Y組與P組同S組表達量相當,較M組表達量高,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。各組LC3B總表達量,在非抑制劑干預的治療組(Y組和P組)均于術后7天上升,于術后28天恢復到基礎水平;而抑制劑干預各組(包括M+CQ、Y+CQ、P+CQ組)在術后28天均低于S組,各組間無統(tǒng)計學差異。術后7天各組LC3B總表達量,與S組相比,Y組顯著升高,P組次之,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是自噬更新情況的代表,從免疫印跡結果可見,術后7天各組LC3轉化為脂化型(LC3-Ⅱ)較術后28天多,其中Y組最明顯,結合蛋白表達量分析,推測益氣活血藥在有效激活自噬上調同時也促進自噬的有效轉化。術后28天使用抑制劑干預各組較S組低,具有統(tǒng)計學差異(P0.05),其原因可能是損傷早期由于自噬受到抑制,而出現(xiàn)的遠期影響,其具體因素尚需進一步研究。各組p62表達在術后7天非抑制劑干預的治療組(Y組與P組),較M組具有統(tǒng)計學差異(P0.05);抑制劑干預組中僅Y+CQ組較S組具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。無論是否有自噬抑制劑的干預,各組于術后28天表達量均低于S組。各組CathepsinD于術后7天高表達,而術后28天表達同S組無統(tǒng)計學差異。術后7天,所有治療組與相應模型組比較均有統(tǒng)計學差異(P0.05),其中Y組比M組低約40%,而P組較M組高30%,Y組與P組比較具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。益氣活血藥對自噬相關蛋白Beclin-1、LC3B、p62有不同程度的上調,而自噬溶酶體相關蛋白CathepsinD在益氣活血藥組的表達是眾多組中最低的,自噬相關蛋白的上調、自噬溶酶體蛋白的表達相對較低,是自噬更新活躍的表現(xiàn)之一。各非抑制劑干預組中,mTOR表達以術后7天中Y組最高;術后28天的M+CQ組幾乎不表達。術后7天,與S組相比,Y組與P組之間比較具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。抑制劑干預各組于術后7天均低于S組50%,術后28天藥物干預組(Y+CQ組和P+CQ組)較S組和M+CQ組表達低30%-40%,抑制劑干預的治療組間在兩個觀察點間無統(tǒng)計學差異。兩個觀察點中,非抑制劑干預組的p-mTOR表達,均以M組表達較高,與S組相比具有統(tǒng)計學差異(P0.05),而治療組與S組對比無統(tǒng)計學差異。抑制劑干預組中,術后7天僅M+CQ組較S組對比具有統(tǒng)計學差異(P0.05);術后28天各組明顯升高,組間無統(tǒng)計學差異,但較S組對比具有統(tǒng)計學差異。4EBP1及其磷酸化蛋白p-4EBP1,在非抑制劑干預組中,僅P組p-4EBP1在術后28天較S組具有統(tǒng)計學差異,而其他各組之間無統(tǒng)計學差異。與之相相對應的抑制劑干預組則差異明顯,其中4EBP1表達量在各抑制劑干預組之間均低于S組,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。p-4EBP1中,術后7天僅M+CQ組較S組具有統(tǒng)計學差異(P0.05),術后28天僅P+CQ組較S組具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。本實驗通過磷酸化蛋白與總蛋白的灰度比值,了解MI后各組相應通路的活化狀態(tài),通過p-mTOR/mTOR觀察mTOR通路的活化情況,通過p-4EBP1/4EBP1觀察mTOR通路下游通路活化情況。益氣活血藥對mTOR通路有抑制作用,當運用自噬抑制劑干預MI模型,則出現(xiàn)通路的激活狀態(tài)。可見益氣活血藥在MI后術后7天提高自噬,激活自噬流并增加自噬更新。而自噬在術后28天恢復基礎水平,而與蛋白質合成相關的信號通路p-mTOR/mTOR以及下游信號通路p-4EBP1/4EBP1則活躍。結合心臟功能改善情況綜合考慮,益氣活血藥使得MI后心室重塑向良性方向發(fā)展。這一系列過程是通過mTOR途徑調控相關信號對MI大鼠心室重塑的影響。Ubiquitin表達在非抑制劑干預的各組兩個觀察時間點,均無統(tǒng)計學差異;而運用抑制劑干預各組,在術后7天表達均低于S組,具有統(tǒng)計學差異(P0.05),而術后28天表達僅抑制劑干預治療組具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。Ubiquitin表達在非抑制劑干預的各組兩個觀察時間點,與S組表達差異不明顯;而運用抑制劑干預的治療組,兩個觀察點表達均低于S組�？梢酝茰y,Ubiquitin主要在術后28天較活躍,而術后7天的降解主要以自噬為主。為此,我們觀察Ubiquitin、Cathepsin D與p62比值,從趨勢圖中可見,CathepsinD與p62比值在兩個時間點均高于Ubiquitin。推測在MI后大鼠心臟組織中,蛋白質降解以自噬為主,以術后7天最顯著,而UPS蛋白降解參與自噬“泛素化”階段,術后28天的蛋白質降解,UPS與自噬均有,均在基礎水平。結論:益氣活血藥提高自噬可能是減少心肌梗死后心臟重塑的一種治療策略。1.益氣活血藥治療的動物減輕心梗后重塑,在術后28天改善心功能,減緩射血分數(shù)降低,對左心室收縮末期直徑、左心室終末期容積以及心肌細胞大小均較非治療組較小。改善心功能效果與培哚普利相當,其中在改善心肌細胞肥大上益氣活血藥占優(yōu)勢。同時對心肌纖維化程度有改善。2.益氣活血藥上調術后7天,上調自噬相關蛋白Beclin-1、LC3B、p62和自噬溶酶體蛋白Cathepsin D,提高自噬流并加速自噬更新。3.益氣活血藥在術后7天以蛋白質降解為主,抑制蛋白質合成;而在術后28天,以蛋白質合成為主,使得蛋白質合成與分解趨于平衡。4.益氣活血藥可能通過mTOR途徑干預自噬并抑制蛋白質的合成,對mTOR及其下游蛋白質合成相關通路4EBP1在術后7天具有抑制作用,在術后28天則有上調作用,使得心肌梗死后心室重塑向良性方向發(fā)展。
【圖文】：

逡逑射血分數(shù)（ＥＦ％）（表１，圖１），術后７天和術后２８天，與Ｓ組相比，Ｍ組與Ｍ＋ＣＱ逡逑組均顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（Ｐ＜ａ0５）；術后７天和術后２８天，Ｍ組與Ｍ＋ＣＱ組間逡逑無統(tǒng)計學差異。逡逑術后７天，與Ｓ組相比，各藥物治療組（包括Ｙ、Ｐ、Ｙ＋ＣＱ和Ｐ＋ＣＱ組）于術后均逡逑下降，具有統(tǒng)計學差異0Ｐ＜０．0５）。與Ｍ組相比，Ｙ組與Ｐ組無統(tǒng)計學差異；與Ｍ＋ＣＱ逡逑組相比，Ｙ＋ＣＱ組與Ｐ＋ＣＱ組無統(tǒng)計學差異。Ｙ與Ｐ組間、Ｙ＋ＣＱ與Ｐ＋ＣＱ組間無統(tǒng)計逡逑學差異。逡逑術后２８天，與Ｓ組相比，各藥物治療組（包括Ｙ、Ｐ、Ｙ＋ＣＱ和Ｐ＋ＣＱ組）具有統(tǒng)計逡逑學差異（尸＜０．0５）。與Ｍ組相比，Ｙ組與Ｐ組較高，具有統(tǒng)計學差異（Ｐ＜０．０５）；與Ｍ＋ＣＱ逡逑組相比，Ｙ＋ＣＱ組與Ｐ＋ＣＱ組較高，具有統(tǒng)計學差異（ＰＨ）。Ｙ與Ｐ組間、Ｙ＋ＣＱ與逡逑Ｐ＋ＣＱ組間無統(tǒng)計學差異。逡逑從術后７天ＥＦ表達可以判斷

逑左室舒張末內徑（ＬＶＩＤｄ）和左室收縮末內徑（ＬＶＩＤｓ）在無藥物干預的模型組中逡逑顯著增大，尤以術后２８天為甚。（表１，圖２）逡逑術后７天和術后２８天，與Ｓ組相比，Ｍ組與Ｍ＋ＣＱ組均升高，具有統(tǒng)計學差異逡逑0Ｐ＜ｆｔ０５）；術后７天和術后２８天，Ｍ組與Ｍ＋ＣＱ組間無統(tǒng)計學差異。逡逑術后７天，與Ｓ組相比，各藥物治療組（包括Ｙ、Ｐ、Ｙ＋ＣＱ和Ｐ＋ＣＱ組）均升高，逡逑具有統(tǒng)計學差異與Ｍ組相比，Ｙ組與Ｐ組無統(tǒng)計學差異；與Ｍ＋ＣＱ組相比，逡逑Ｙ＋ＣＱ組和Ｐ＋ＣＱ組無統(tǒng)計學差異。Ｙ與Ｐ組間、Ｙ＋ＣＱ與Ｐ＋ＣＱ組間無統(tǒng)計學差異。逡逑術后２８天，與Ｓ組相比，各藥物治療組（包括Ｙ、Ｐ、Ｙ＋ＣＱ和Ｐ＋ＣＱ組）均升高，逡逑具有統(tǒng)計學差異與Ｍ組相比，Ｙ組與Ｐ組，具有統(tǒng)計學差異ＣＰ＜ａ0５）；與逡逑Ｍ＋ＣＱ組相比，Ｙ＋ＣＱ組和Ｐ＋ＣＱ組無統(tǒng)計學差異。逡逑在術后２８天
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2600365