【摘要】：傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中,石菖蒲作為許多中藥的活性組分,被用于治療多種疾病。據(jù)文獻報道,石菖蒲具有神經(jīng)保護、抗炎癥、抗氧化等多種生物活性。石菖蒲已被用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性炎癥性骨疾病,破骨細胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理進程中發(fā)揮重要作用。破骨細胞是一種多核的巨大細胞,是體內(nèi)唯一行使骨吸收功能的細胞。目前越來越多的研究將破骨細胞作為治療骨疾病的靶點,而石菖蒲在這類骨疾病上的研究目前還較少。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)了一個由石菖蒲根莖中提取的以α-asarone為母核的木質(zhì)素類化合物Tatarinan O(TO),對破骨細胞生成有抑制作用。此外還有其它幾個石菖蒲根莖中提取的木質(zhì)素類化合物,均與TO同為α-asarone的多聚體。但是這些以α-asarone為母核的化合物是否可以同樣調(diào)節(jié)破骨細胞的分化及骨吸收功能仍然沒有報道。因此,我們將研究這些化合物對破骨細胞分化及骨吸收功能的作用及其機制。通過TRAP染色實驗,我們檢測了這些化合物對破骨細胞分化的作用。我們發(fā)現(xiàn)僅有Tatarinan N(TN)與Tatarinan T(TT)這兩個化合物能夠?qū)ANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化有抑制作用,其它的幾個化合物均不影響破骨細胞分化。在之后的研究中,我們進一步檢測了TN與TT對RANKL引起的破骨細胞分化和LPS誘導(dǎo)的小鼠骨丟失的抑制作用,并對其作用機制進行了研究。在細胞形態(tài)學(xué)上,我們分別進行了TRAP染色、骨吸收和F-actin環(huán)染色實驗。結(jié)果表明TN和TT在RANKL引起的破骨細胞分化早期階段以濃度依賴的方式抑制破骨細胞生成,F-actin環(huán)形成及其骨吸收功能。為闡明TN和TT調(diào)節(jié)RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞生成和骨吸收功能的分子機制,我們通過熒光定量PCR方法檢測了一些破骨細胞相關(guān)基因表達的變化。這些基因包括OSCAR,DC-STAMP,αvβ3,Apt6v0d2,TRAP,Cts K和MMP-9。研究表明TN和TT均顯著抑制這些RANKL誘導(dǎo)的標志性基因的表達。這些數(shù)據(jù)顯示TN和TT能夠通過調(diào)節(jié)標志性基因的表達來阻礙破骨細胞分化,F-actin環(huán)形成和骨吸收功能。NFATc1是調(diào)節(jié)破骨細胞分化的核心轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)著破骨細胞相關(guān)基因的表達。實驗表明,TN和TT均能夠在mRNA水平和蛋白水平上顯著抑制NFATc1的表達。這說明TN和TT可能通過調(diào)節(jié)NFATc1來抑制標志性基因的表達及破骨細胞分化。此外,TN和TT還可以抑制NFATc1的上游轉(zhuǎn)錄因子c-Fos在mRNA水平和蛋白水平上的表達。為了進一步闡明TN和TT調(diào)控破骨細胞分化的作用機制,我們繼續(xù)通過western blot實驗,免疫熒光實驗和fluo-4 AM鈣離子探針觀察了TN和TT調(diào)節(jié)NFATc1活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。結(jié)果表明TN顯著抑制RANKL引起的NF-κB,ERK,p38通路和Syk-Btk-PLCγ2級聯(lián)反應(yīng)的活化。此外,TN能夠抑制胞內(nèi)鈣離子水平的升高和鈣依賴磷酸酶催化亞基PP2B-Aα的表達。與TN不同,TT不影響上述信號通路的活化。最后,我們通過動物實驗進一步研究了TN和TT對LPS引起的小鼠骨丟失的潛在作用。Micro-CT結(jié)果表明,TN和TT均改善LPS引起的骨顯微結(jié)構(gòu)指標的變化,包括骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁離散度(Tb.Sp)、骨密度(BMD)、骨體積/總體積(BV/TV)。HE染色和TRAP染色結(jié)果表明,TN和TT能夠有效緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠骨組織結(jié)構(gòu)破壞和破骨細胞過度活化。這些結(jié)果表明,TN和TT均對LPS誘導(dǎo)的小鼠骨丟失具有保護作用。總結(jié):體外細胞學(xué)研究表明,TN與TT均能夠抑制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFATc1和c-Fos,并下調(diào)破骨細胞標志性基因的表達,阻礙骨架蛋白F-actin環(huán)形成,從而抑制RANKL誘導(dǎo)破骨細胞分化,減少骨吸收面積。研究表明,TN可能通過抑制NF-κB,MAPKs和PLCγ2-Ca~(2+)-calcineurin信號通路活化來調(diào)節(jié)NFATc1的活化;而TT不影響上述信號通路的活化。體內(nèi)研究表明,TN及TT給藥均可以顯著改善LPS引起的小鼠骨結(jié)構(gòu)破壞及破骨細胞過度活化。我們的研究表明TN和TT均可以作為破骨細胞相關(guān)的骨丟失性相關(guān)疾病的潛在治療藥物。
【圖文】：

rone 表現(xiàn)出抗氧化活性 的水平，抑制血管緊張高血壓模型比較石菖蒲取物可降低模型大鼠心發(fā)現(xiàn)，，石菖蒲中提取的生成，減少骨吸收面積質(zhì)疏松潛在藥物[16]。

(C)中提取的木質(zhì)素類化合物對 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細提取的木質(zhì)素類活性單體化學(xué)結(jié)構(gòu)式；（B）木質(zhì)素（C）木質(zhì)素類化合物影響破骨細胞生成統(tǒng)計學(xué)結(jié)果he effects of lignin-like compounds extracted from AcoSchott on RANKL-induced osteoclast formationcture of lignin-like compounds that extracted from AcoRAP staining assay result; (C) statistic result of lignin-leffecting osteoclast formation. **p≤0.01示了在破骨細胞培養(yǎng)初期加入不同濃度的 TN 進行干 μM TN 進行干預(yù)的結(jié)果。如圖 2.2A 和 B 所示，在培進行干預(yù)時，TN 能夠以濃度依賴的形式抑制 RAN 濃度在 0.625 μM 及以下時，對破骨細胞幾乎沒有作
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2597571