發(fā)布時(shí)間：2020-03-24 01:20

【摘要】：傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中,石菖蒲作為許多中藥的活性組分,被用于治療多種疾病。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,石菖蒲具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎癥、抗氧化等多種生物活性。石菖蒲已被用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性炎癥性骨疾病,破骨細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。破骨細(xì)胞是一種多核的巨大細(xì)胞,是體內(nèi)唯一行使骨吸收功能的細(xì)胞。目前越來越多的研究將破骨細(xì)胞作為治療骨疾病的靶點(diǎn),而石菖蒲在這類骨疾病上的研究目前還較少。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由石菖蒲根莖中提取的以α-asarone為母核的木質(zhì)素類化合物Tatarinan O(TO),對(duì)破骨細(xì)胞生成有抑制作用。此外還有其它幾個(gè)石菖蒲根莖中提取的木質(zhì)素類化合物,均與TO同為α-asarone的多聚體。但是這些以α-asarone為母核的化合物是否可以同樣調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能仍然沒有報(bào)道。因此,我們將研究這些化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的作用及其機(jī)制。通過TRAP染色實(shí)驗(yàn),我們檢測(cè)了這些化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化的作用。我們發(fā)現(xiàn)僅有Tatarinan N(TN)與Tatarinan T(TT)這兩個(gè)化合物能夠?qū)ANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化有抑制作用,其它的幾個(gè)化合物均不影響破骨細(xì)胞分化。在之后的研究中,我們進(jìn)一步檢測(cè)了TN與TT對(duì)RANKL引起的破骨細(xì)胞分化和LPS誘導(dǎo)的小鼠骨丟失的抑制作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上,我們分別進(jìn)行了TRAP染色、骨吸收和F-actin環(huán)染色實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明TN和TT在RANKL引起的破骨細(xì)胞分化早期階段以濃度依賴的方式抑制破骨細(xì)胞生成,F-actin環(huán)形成及其骨吸收功能。為闡明TN和TT調(diào)節(jié)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和骨吸收功能的分子機(jī)制,我們通過熒光定量PCR方法檢測(cè)了一些破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的變化。這些基因包括OSCAR,DC-STAMP,αvβ3,Apt6v0d2,TRAP,Cts K和MMP-9。研究表明TN和TT均顯著抑制這些RANKL誘導(dǎo)的標(biāo)志性基因的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)顯示TN和TT能夠通過調(diào)節(jié)標(biāo)志性基因的表達(dá)來阻礙破骨細(xì)胞分化,F-actin環(huán)形成和骨吸收功能。NFATc1是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的核心轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)著破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明,TN和TT均能夠在mRNA水平和蛋白水平上顯著抑制NFATc1的表達(dá)。這說明TN和TT可能通過調(diào)節(jié)NFATc1來抑制標(biāo)志性基因的表達(dá)及破骨細(xì)胞分化。此外,TN和TT還可以抑制NFATc1的上游轉(zhuǎn)錄因子c-Fos在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)。為了進(jìn)一步闡明TN和TT調(diào)控破骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制,我們繼續(xù)通過western blot實(shí)驗(yàn),免疫熒光實(shí)驗(yàn)和fluo-4 AM鈣離子探針觀察了TN和TT調(diào)節(jié)NFATc1活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。結(jié)果表明TN顯著抑制RANKL引起的NF-κB,ERK,p38通路和Syk-Btk-PLCγ2級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活化。此外,TN能夠抑制胞內(nèi)鈣離子水平的升高和鈣依賴磷酸酶催化亞基PP2B-Aα的表達(dá)。與TN不同,TT不影響上述信號(hào)通路的活化。最后,我們通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了TN和TT對(duì)LPS引起的小鼠骨丟失的潛在作用。Micro-CT結(jié)果表明,TN和TT均改善LPS引起的骨顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)的變化,包括骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁離散度(Tb.Sp)、骨密度(BMD)、骨體積/總體積(BV/TV)。HE染色和TRAP染色結(jié)果表明,TN和TT能夠有效緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠骨組織結(jié)構(gòu)破壞和破骨細(xì)胞過度活化。這些結(jié)果表明,TN和TT均對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠骨丟失具有保護(hù)作用�？偨Y(jié):體外細(xì)胞學(xué)研究表明,TN與TT均能夠抑制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFATc1和c-Fos,并下調(diào)破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá),阻礙骨架蛋白F-actin環(huán)形成,從而抑制RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化,減少骨吸收面積。研究表明,TN可能通過抑制NF-κB,MAPKs和PLCγ2-Ca~(2+)-calcineurin信號(hào)通路活化來調(diào)節(jié)NFATc1的活化;而TT不影響上述信號(hào)通路的活化。體內(nèi)研究表明,TN及TT給藥均可以顯著改善LPS引起的小鼠骨結(jié)構(gòu)破壞及破骨細(xì)胞過度活化。我們的研究表明TN和TT均可以作為破骨細(xì)胞相關(guān)的骨丟失性相關(guān)疾病的潛在治療藥物。
【圖文】：

rone 表現(xiàn)出抗氧化活性 的水平，抑制血管緊張高血壓模型比較石菖蒲取物可降低模型大鼠心發(fā)現(xiàn)，，石菖蒲中提取的生成，減少骨吸收面積質(zhì)疏松潛在藥物[16]。

(C)中提取的木質(zhì)素類化合物對(duì) RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)提取的木質(zhì)素類活性單體化學(xué)結(jié)構(gòu)式；（B）木質(zhì)素（C）木質(zhì)素類化合物影響破骨細(xì)胞生成統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果he effects of lignin-like compounds extracted from AcoSchott on RANKL-induced osteoclast formationcture of lignin-like compounds that extracted from AcoRAP staining assay result; (C) statistic result of lignin-leffecting osteoclast formation. **p≤0.01示了在破骨細(xì)胞培養(yǎng)初期加入不同濃度的 TN 進(jìn)行干 μM TN 進(jìn)行干預(yù)的結(jié)果。如圖 2.2A 和 B 所示，在培進(jìn)行干預(yù)時(shí)，TN 能夠以濃度依賴的形式抑制 RAN 濃度在 0.625 μM 及以下時(shí)，對(duì)破骨細(xì)胞幾乎沒有作
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2597571