發(fā)布時間：2020-03-24 00:06

【摘要】：甘草作為我國最常用的大宗藥材之一,具備補脾益氣,清熱解毒,祛痰止咳,緩急止痛,調(diào)和諸藥等多種功效�！吨袊幍洹纷�2010版明確規(guī)定:按干燥品計算,甘草樣品中甘草苷(C_(21)H_(22)O_9)的含量不得少于0.50%。目前,栽培甘草廣泛存在品質(zhì)退化及甘草苷含量低等問題,難以達到藥典規(guī)定的最低標準。查爾酮合酶(Chalcone synthase,CHS)作為甘草苷生物合成途徑中的第一個關(guān)鍵酶和限速酶,對于調(diào)控甘草中黃酮類化合物的生物合成具有重要作用。研究功能基因CHS的多態(tài)性及其對黃酮類化合物積累的作用機制,對于提高栽培甘草質(zhì)量,指導(dǎo)甘草分子育種具有重要的理論價值和實踐意義。本論文對60株同一栽培條件下的兩年生甘草進行了 4種主要黃酮類化合物的含量測定;從含量最高的烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)及含量最低的脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)中篩選樣品,利用RT-PCR法克隆CHS基因,并對其進行多態(tài)性分析;研究甘草CHS基因編碼區(qū)SNP位點與甘草中黃酮類化合物含量間的相關(guān)性,篩選出甘草黃酮高/低含量對應(yīng)的特異CHS基因型;構(gòu)建重組酵母表達載體pPIC9K-CHS,采用電轉(zhuǎn)化法將特異CHS基因?qū)氘叧嘟湍窯S115菌株中,經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后,利用SDS-PAGE進行檢測。本論文共取得了如下研究結(jié)果:(1)三基原甘草樣品中4種主要黃酮類化合物的含量測定結(jié)果:利用HPLC法對同一栽培條件下的兩年生烏拉爾甘草、光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)、脹果甘草各20株進行甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素的含量測定,發(fā)現(xiàn):4種黃酮類化合物的含量均具有顯著相關(guān)關(guān)系,在三基原甘草樣品間均存在顯著性差異,且烏拉爾甘草中含量均為最高,光果甘草次之,脹果甘草最低。將含量最高的5株烏拉爾甘草作為黃酮高含量組,將含量最低的5株脹果甘草作為黃酮低含量組,進行后續(xù)CHS基因的克隆及序列分析。(2)甘草CHS基因的克隆及序列分析結(jié)果:從黃酮高/低含量組樣品中共計克隆得到336條CHS基因cDNA序列,全長均為1175 bp,包含1個完整的開放閱讀框,編碼1條由389個氨基酸殘基組成的多肽。經(jīng)DNAMAN比對分析,這336條cDNA序列可確定為137種單倍型(單倍型1～137),一致性為98.98%,存在249個變異位點;編碼102種氨基酸序列類型(AA-1～AA-102),一致性為99.40%,存在130個變異位點。在GenBank數(shù)據(jù)庫中完成全部序列的注冊。(3)甘草CHS基因多態(tài)性分析結(jié)果:對137種甘草CHS基因單倍型及其編碼的102種氨基酸序列類型進行分析,統(tǒng)計結(jié)果顯示:甘草的主流CHS基因型為單倍型10及92,其對應(yīng)氨基酸序列類型為AA-3及AA-60;黃酮高含量組甘草樣品特異主流CHS基因型為單倍型60,其對應(yīng)氨基酸序列類型為AA-35;黃酮低含量組甘草樣品特異主流CHS基因型為單倍型63,其對應(yīng)氨基酸序列類型為AA-36。(4)甘草黃酮高/低含量組特異CHS氨基酸序列(AA-35與AA-36)的生物信息學(xué)分析結(jié)果:理化性質(zhì):甘草CHS蛋白分子量大小約為43 KDa,氨基酸序列AA-35和AA-36的等電點、不穩(wěn)定系數(shù)及親水系數(shù)差別較小,且半衰期一致。二級結(jié)構(gòu):AA-35和AA-36的二級結(jié)構(gòu)僅在193位點處存在無規(guī)卷曲/延長鏈、225位點處存在無規(guī)卷曲/延長鏈、237位點處存在α-螺旋/延長鏈的差異,與一級結(jié)構(gòu)差異較一致。且活性位點均為164位點,活性區(qū)域均為156位點至172位點之間。三級結(jié)構(gòu):AA-35和AA-36的同源模建結(jié)構(gòu)均具有良好的立體化學(xué)參數(shù)和空間結(jié)構(gòu),可用于后續(xù)分析。模建蛋白結(jié)合位點分析結(jié)果顯示,僅AA-35的229位纈氨酸位于結(jié)合位點區(qū)域,能夠與丙二酰輔酶A結(jié)合,而AA-35的193位異亮氨酸、AA-36的193位纈氨酸與229位蘇氨酸均與底物結(jié)合無關(guān)�？蓮姆肿铀缴贤茰y解釋黃酮高/低含量組甘草樣品中特異性CHS氨基酸序列AA-35與AA-36在193、229位點處的差異與黃酮不同水平的積累相關(guān)。聚類分析:通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,發(fā)現(xiàn)CHS氨基酸序列在不同類別生物樣本間具有良好的區(qū)分度,與其進化關(guān)系一致。甘草主流CHS氨基酸序列AA-3與AA-60先聚為一支,再與黃酮低含量組特有氨基酸序列AA-36聚為一支,最后與黃酮高含量組特有氨基酸序列AA-35聚為一支。以上聚類結(jié)果可以從進化關(guān)系層面上解釋黃酮高/低含量組特有氨基酸序列AA-35/AA-36的差異明顯。(5)轉(zhuǎn)甘草特異性CHS基因畢赤酵母工程菌構(gòu)建及表達分析:以pPIC9K為載體,構(gòu)建了攜帶甘草特異CHS基因型的畢赤酵母GS115工程菌GS115-P-CHS10、GS115-P-CHS92、GS115-P-CHS60 和 GS115-P-CHS63,經(jīng) His~+轉(zhuǎn)化子、遺傳霉素 G418及Mut+型重組子篩選后,利用PCR及測序法進行驗證,經(jīng)甲醇對驗證正確的工程菌進行誘導(dǎo)表達后,利用SDS-PAGE進行檢測,得到與甘草CHS蛋白大小一致(43 kDa)的產(chǎn)物,即誘導(dǎo)表達成功。
【圖文】：

基于ＯＫ基因多態(tài)性的甘草黃酮類化合物生物合成分子機制研究合成具有重要作用。其催化第一步反應(yīng)，將３分子的丙二酰輔酶Ａ（ｍａｌ0ｎｙｌ－子的４－香豆酰輔酶Ａ邋（４－ｃｏｕｍａｒｏｙｌ－ＣｏＡ）結(jié)合，形成第１個具有Ｃ１３骨合物一柚皮素查爾酮（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ邋ｃｈａｌｃｏｎｅ邋），該產(chǎn)物進一步衍化生成了各［１９］。因此，深入分子水平研究與黃酮類化合物生物合成直接相關(guān)的功能基性及其對黃酮類化合物積累的作用機制，對于優(yōu)質(zhì)甘草藥材的分子育種具價值和實踐意義。逡逑

邐基于Ｃ７Ｃ基因多態(tài)性的甘草黃酮類化合物生物合成分子機制研究邐逡逑ＶＷＤ１邋Ａ，邋ｉ＾｛ｘ＝２７６邋ｎｍ，，邋ＩＴ邋（２０ｉａｉ０２１＼Ｒ６邋ｔ0２１邋Ｄ）逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284

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2 張曉冬;周姍;尹彥超;胡婷;高智強;韓沂霖;李文東;劉穎;;甘草CHS基因多態(tài)性與甘草苷含量的相關(guān)性分析[J];藥學(xué)學(xué)報;2018年04期

3 鄧文輝;張濤;吳三橋;李新生;;黑稻CHS基因外顯子Ⅱ部分序列遺傳變異分析[J];種子;2011年09期

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本文編號：2597481