【摘要】：背景:當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根,具有補(bǔ)血、和血和調(diào)經(jīng)止痛等功效,自古以來多用于婦科方面疾病。揮發(fā)油為當(dāng)歸的主要活性成分之一,而藁本內(nèi)酯(Z-ligusilide,Z-LIG)是其揮發(fā)油的主要成分,約占50%以上。雌激素受體α(Estrogen receptor alpha,ERα)陰性表達(dá)(ERα-)患者在乳腺癌中約占30%,對傳統(tǒng)內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)不敏感,臨床預(yù)后不良,具有較高死亡率。近年發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯對結(jié)腸癌、前列腺癌、白血病以及腦腫瘤均具有抑制作用。但是關(guān)于其主要成分藁本內(nèi)酯用于ERα-乳腺癌細(xì)胞方面的作用還未有報道。目的:本研究以三種ERα-乳腺癌細(xì)胞為研究對象,探究當(dāng)歸揮發(fā)油與藁本內(nèi)酯是否能夠通過恢復(fù)ERα-乳腺癌細(xì)胞中ERα表達(dá)而增敏他莫昔芬的抑制作用,并對藁本內(nèi)酯如何恢復(fù)ERα及與他莫昔芬產(chǎn)生協(xié)同抑制作用的機(jī)制進(jìn)行了初步研究,為當(dāng)歸及藁本內(nèi)酯用于ERα-乳腺癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。方法:在研究當(dāng)歸揮發(fā)油及藁本內(nèi)酯恢復(fù)他莫昔芬對ERα-乳腺癌細(xì)胞的抑制作用方面:首先,采用黃酰羅丹明B(SRB)法,以當(dāng)歸揮發(fā)油或藁本內(nèi)酯與他莫昔芬單獨或合用處理三種ERα-乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、HS578t和MDA-MB-453)72h。同時,用苔盼藍(lán)拒染法和克隆形成實驗考察了藁本內(nèi)酯與他莫昔芬對此三種細(xì)胞的增殖及克隆形成能力的影響。在進(jìn)一步的機(jī)制研究中,我們用流式細(xì)胞儀、Hochest33342染色和Western blotting實驗分別對凋亡和周期進(jìn)行了探究。在探究藁本內(nèi)酯對ERα表達(dá)的影響及ERα在藁本內(nèi)酯與他莫昔芬協(xié)同抑制活性中的作用方面:以當(dāng)歸揮發(fā)油與藁本內(nèi)酯分別處理此三種ERα-乳腺癌細(xì)胞,用Western blotting對ERα蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。此外,為檢恢復(fù)的ERα對雌激素應(yīng)答活性元件(ERE)活性的影響,我們采用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)進(jìn)行了檢測。最后用ERα蛋白拮抗劑-氟維斯群(ICI182780)及si-ERα方法,通過SRB、克隆形成等實驗評估了所恢復(fù)的ERα在藁本內(nèi)酯與他莫昔芬協(xié)同作用中的地位。在藁本內(nèi)酯恢復(fù)ERα表達(dá)的機(jī)制方面:結(jié)合研究報道,我們從組蛋白H3(lys9/14)的去乙酰化角度進(jìn)行了相關(guān)實驗。首先,我們用Western blotting檢測了藁本內(nèi)酯不同劑量和時間點對MDA-MB-231細(xì)胞中Ace-H3(lys9/14)的表達(dá)影響。然后,用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)法觀察藁本內(nèi)酯對細(xì)胞ERα啟動子上Ace-H3(lys9/14)結(jié)合水平有無影響。其次,我們用Western blotting考察了能夠抑制ERα轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)因子MTA1、IFI16與HDACs(HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7)的表達(dá)情況,用Ch IP法檢測了這些因子在ERα啟動子上的結(jié)合情況。并給藥藁本內(nèi)酯檢測對它們在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和在ERα啟動子上結(jié)合的影響。同時,我們用基因過表達(dá)的方法,將MTA1、IFI16、HDAC1和HDAC7分別過表達(dá)后,考察它們對藁本內(nèi)酯上調(diào)ERα的能力和藁本內(nèi)酯與他莫昔芬協(xié)同抑制作用所產(chǎn)生的影響。最后,我們通過免疫沉淀(IP)實驗檢測了藁本內(nèi)酯對以MTA1為主體招募IFI16與HDACs(HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7)因子所形成復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果:當(dāng)歸揮發(fā)油與他莫昔芬處理三種ERα-乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、HS578t和MDA-MB-453細(xì)胞)72h后,結(jié)果顯示二者單獨對此三種細(xì)胞的存活率均無明顯抑制作用,但當(dāng)合用時,卻對此三種細(xì)胞均產(chǎn)生顯著抑制作用,其中MDA-MB-231最為敏感。隨后,考察藁本內(nèi)酯與他莫昔芬的作用,發(fā)現(xiàn)二者合用對此三種細(xì)胞的存活率亦顯示出類似的協(xié)同抑制作用,且同樣觀察到MDA-MB-231較另外兩種細(xì)胞更敏感。進(jìn)一步的苔盼藍(lán)拒染法和克隆形成實驗顯示藁本內(nèi)酯與他莫昔芬合用可顯著抑制此三種細(xì)胞的增殖與克隆形成能力。在隨后的凋亡和周期機(jī)制探究中,流式細(xì)胞儀和Hochest33342染色得出藁本內(nèi)酯與他莫昔芬可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生近2倍凋亡率,且細(xì)胞核明顯變亮和皺縮破碎。同時細(xì)胞的S和G2/M期發(fā)生明顯阻滯。而進(jìn)一步的Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),二者合用可以通過誘導(dǎo)凋亡標(biāo)志性蛋白p53上升,進(jìn)一步促進(jìn)了pro-PARP、pro-caspase 3、cleaved-PARP和cleaved-caspase 3轉(zhuǎn)換表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外,還能夠通過上調(diào)Acetyl-p53與BRCA1表達(dá),進(jìn)一步使p21上調(diào),同時促進(jìn)周期阻滯蛋白p27而使與S和G2/M期有關(guān)的CDK1、CDK2、Cyclin A與Cyclin E蛋白含量下降而阻滯周期。用Western Blotting實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油(10、20與40μg/m L)與藁本內(nèi)酯(10、25與50μM)均能恢復(fù)三種ERα-乳腺癌細(xì)胞中ERα的表達(dá)。且藁本內(nèi)酯上調(diào)ERα后能進(jìn)一步激活下游啟動子ERE的活性,而單獨的他莫昔芬對其無作用,但他莫昔芬能阻斷藁本內(nèi)酯對ERE的激活。用氟維斯群(ICI182780)或si-ERα處理后,由于降低了藁本內(nèi)酯對ERα的恢復(fù),造成藁本內(nèi)酯與他莫昔芬的協(xié)同抑制作用被逆轉(zhuǎn)。在ERα恢復(fù)機(jī)制研究中,Western Blotting顯示隨著藁本內(nèi)酯(10、25與50μM)劑量及時間點(0、24、48與72h)增加,Ace-H3(lys9/14)蛋白含量逐漸增加。而參與組蛋白修飾的MTA1、IFI16與HDACs(HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7)蛋白均被下調(diào)。通過ChIP實驗,我們發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯(50μM)可以通過降低MTA1、IFI16與HDACs(HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7)在ERα啟動子上的富集,而增加Ace-H3(lys9/14)在ERα啟動子的結(jié)合水平。進(jìn)一步過度表達(dá)MTA1、HDAC1、HDAC7與IFI16,我們發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯上調(diào)ERα的能力被減弱,同時,藁本內(nèi)酯與他莫昔芬的協(xié)同抑制作用也被反轉(zhuǎn)。最后,IP實驗顯示,MTA1與其它因子均有相互結(jié)合。但藁本內(nèi)酯(50μM)給藥后,可能由于藁本內(nèi)酯降低了它們各自的表達(dá)而使得MTA1與其它因子結(jié)合程度均明顯降低,從而影響了MTA1/IFI16/HDACs所形成的NuRD復(fù)合物穩(wěn)定性。結(jié)論:藁本內(nèi)酯能夠通過降低MTA1、IFI16和HDACs(HDAC1、HDAC2與HDAC4/5/7)表達(dá)及在ERα啟動子上的結(jié)合,而影響MTA1/IFI16/HDACs所形成的NuRD復(fù)合物穩(wěn)定性,使得ERα啟動子上組蛋白H3(lys9/14)乙�；皆黾�,最終使ERα恢復(fù)表達(dá),從而使他莫昔芬對ERα-乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用,且此協(xié)同抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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