【摘要】：目的:觀察益氣活血通絡方對體外高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)炎癥和凋亡的影響,探討其與JNK信號通路的關系,闡釋基于JNK通路的益氣活血通絡方對糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)干預作用的細胞分子機制。方法:1、體外培養(yǎng)HUVECs,然后用不同處理因素的DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度分別為:5.55mmol/L、11.1mmol/L、22.2mmol/L、33.3mmol/L、44.4mmol/L)分別培養(yǎng)12h、24h、48h。用MTT法、Hoechst 33258熒光染色法和流式細胞術三種方法分別檢測不同濃度葡萄糖在不同時間點對臍靜脈內皮細胞存活率及凋亡的影響。2、選擇健康的SPF級SD雄性大鼠30只,隨機分為兩組:益氣活血通絡方含藥血清組、大鼠空白對照血清組。兩組分別予以中藥復方益氣活血通絡方和等體積的生理鹽水灌胃,制備相應的含藥血清。將細胞傳代后,隨機分為6組:正常組、模型組、益氣活血通絡方低濃度組、益氣活血通絡方中濃度組、益氣活血通絡方高濃度組和西藥硫辛酸對照組。將HUVECs進行高糖造模48h后,分別加入含大鼠空白血清的低糖培養(yǎng)基、含不同濃度藥物血清的高糖DMEM培養(yǎng)基和含西藥硫辛酸的高糖培養(yǎng)基干預細胞24 h。用酶聯(lián)免疫吸附法和Western blotting法檢測內皮細胞上清液中和細胞內炎性因子IL-1β、TNF-α的表達。3、用高濃度葡萄糖給細胞造模48h后,分別用不同濃度的含藥血清和西藥硫辛酸對細胞進行干預。24 h后Western blotting法檢測內皮細胞中JNK、P-JNK蛋白的表達;熒光定量PCR的方法測定臍靜脈內皮細胞中JNK mRNA的相對表達量。用Hoechst 33258熒光染色法和Annexin V-FITC/PI雙染法觀察益氣活血通絡方對臍靜脈內皮細胞形態(tài)學和凋亡率的影響。收集細胞,Western blotting和RT-PCR法分別檢測內皮細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白和mRNA的表達。結果:1、MTT法檢測不同濃度葡萄糖干預不同時間對HUVECs存活率的影響:葡萄糖濃度為33.3 mmol/L的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)內皮細胞48 h后,細胞的存活率趨于50%,活力顯著降低(P0.01)。經(jīng)Hoechest 33258熒光染色法和流式細胞術AnnexinV FITC/PI雙染色法檢測發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)基內葡萄糖濃度的增加和高糖干預時間的延長,凋亡細胞逐漸增加。當用葡萄糖濃度為33.3 mmol/L的高糖培養(yǎng)基處理細胞48 h時,內皮細胞凋亡的細胞數(shù)明顯增加,而且呈現(xiàn)出致密的濃染,細胞核的形態(tài)變化明顯,細胞凋亡率也顯著增加。2、益氣活血通絡方對內皮細胞炎性因子表達的影響:與正常組比較,高濃度的葡萄糖可引起HUVECs內IL-1β及TNF-α分泌增加,使這兩個炎性因子蛋白表達均增高(P0.05);與模型組比較,各濃度的益氣活血通絡方含藥血清和西藥硫辛酸可以顯著抑制IL-1β、TNF-α的分泌和蛋白的高表達(P0.05)。3、益氣活血通絡方對JNK信號通路的影響:與正常組相比,用高濃度的葡萄糖刺激,可顯著增加HUVECs內JNK、P-JNK蛋白的表達,增加JNK m RNA的相對表達量;用益氣活血通絡方含藥血清及西藥硫辛酸干預以后,均可顯著降低細胞內JNK、P-JNK的表達(P0.01)。益氣活血通絡方對細胞凋亡的影響:與正常組比較,濃度為33.3 mmol/L的高糖模型組細胞存活率顯著降低,內皮細胞的染色質向邊緣聚集,細胞核固縮且呈現(xiàn)出致密的濃染,細胞的凋亡率明顯升高,內皮細胞內Bax及Caspase-3蛋白和mRNA的表達顯著增加,Bcl-2蛋白及m RNA的表達顯著降低(P0.01);用益氣活血通絡方含藥血清及西藥硫辛酸干預以后,均可顯著減輕高糖對HUVECs增殖的抑制及其誘導的細胞凋亡,減少內皮細胞中Bax及Caspase-3的表達,增加Bcl-2的表達(P0.05,P0.01)。結論:1、33.3 mmol/L的高濃度葡萄糖培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞48h,可明顯抑制細胞活性,刺激細胞產(chǎn)生炎性因子,激活JNK通路,HUVECs呈現(xiàn)明顯的凋亡特征,細胞凋亡率顯著升高;2、益氣活血通絡方可明顯抑制臍靜脈內皮細胞內炎性因子的分泌,降低內皮細胞中JNK的表達,對HUVECs的凋亡具有明顯的抑制作用。3、益氣活血通絡方可減輕高糖誘導的內皮細胞炎性損傷,并可以抑制內皮細胞的凋亡,從而對糖尿病周圍神經(jīng)起到保護的作用,其機制可能與JNK信號轉導通路有關。
【圖文】：

第一部分 高糖對人臍靜脈內皮細胞增殖及凋亡的影響3.2 高糖對 HUVECs 凋亡形態(tài)的影響3.2.1 Hoechst33258 熒光染色法觀察不同濃度葡萄糖誘導 HUVE48h 后細胞凋亡形態(tài)的變化染色結果顯示，用不同濃度的葡萄糖（5.55mmol/L、11.1mmol/L、22.2 m3.3 mmol/L、44.4mmol/L ）干預 HUVECs 48 h 后，正常細胞的細胞核呈彌勻暗淡的藍色熒光，而凋亡細胞的細胞核普遍呈現(xiàn)藍白色，呈致密的濃染顯核形態(tài)變化（如圖中的箭頭所示）。隨著葡萄糖濃度的增加，凋亡細胞的來越多，且呈劑量依賴性地增多。與 5.55mmol/L 組相比，當葡萄糖濃度為mol/L 時，，凋亡細胞數(shù)增加，核形態(tài)變化明顯。（見圖 1）

圖 2： 33.3 mmol/L 葡萄糖作用不同時間對 HUVECs 凋亡形態(tài)的的影Fig 2: Effects of 33.3 mmol / L glucose on apoptosis morphology of Hdifferent Time (×100).流式細胞術檢測高糖對 HUVECs 凋亡的影響.1AnnexinV FITC/ PI 雙染色法檢測不同濃度的葡萄的影響如圖 3 所示，用不同濃度的葡萄糖（5.55mmol/L、11.1mmol/ mmol/L、 44.4mmol/L ）干預 HUVECs 48 h 后，與 5.55mm度的高糖均能引起細胞凋亡的發(fā)生，隨著糖濃度的增加，細
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2596411