【摘要】：目的:觀察益氣活血通絡(luò)方對體外高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)炎癥和凋亡的影響,探討其與JNK信號通路的關(guān)系,闡釋基于JNK通路的益氣活血通絡(luò)方對糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)干預(yù)作用的細(xì)胞分子機(jī)制。方法:1、體外培養(yǎng)HUVECs,然后用不同處理因素的DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度分別為:5.55mmol/L、11.1mmol/L、22.2mmol/L、33.3mmol/L、44.4mmol/L)分別培養(yǎng)12h、24h、48h。用MTT法、Hoechst 33258熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)三種方法分別檢測不同濃度葡萄糖在不同時(shí)間點(diǎn)對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率及凋亡的影響。2、選擇健康的SPF級SD雄性大鼠30只,隨機(jī)分為兩組:益氣活血通絡(luò)方含藥血清組、大鼠空白對照血清組。兩組分別予以中藥復(fù)方益氣活血通絡(luò)方和等體積的生理鹽水灌胃,制備相應(yīng)的含藥血清。將細(xì)胞傳代后,隨機(jī)分為6組:正常組、模型組、益氣活血通絡(luò)方低濃度組、益氣活血通絡(luò)方中濃度組、益氣活血通絡(luò)方高濃度組和西藥硫辛酸對照組。將HUVECs進(jìn)行高糖造模48h后,分別加入含大鼠空白血清的低糖培養(yǎng)基、含不同濃度藥物血清的高糖DMEM培養(yǎng)基和含西藥硫辛酸的高糖培養(yǎng)基干預(yù)細(xì)胞24 h。用酶聯(lián)免疫吸附法和Western blotting法檢測內(nèi)皮細(xì)胞上清液中和細(xì)胞內(nèi)炎性因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)。3、用高濃度葡萄糖給細(xì)胞造模48h后,分別用不同濃度的含藥血清和西藥硫辛酸對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。24 h后Western blotting法檢測內(nèi)皮細(xì)胞中JNK、P-JNK蛋白的表達(dá);熒光定量PCR的方法測定臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中JNK mRNA的相對表達(dá)量。用Hoechst 33258熒光染色法和Annexin V-FITC/PI雙染法觀察益氣活血通絡(luò)方對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)和凋亡率的影響。收集細(xì)胞,Western blotting和RT-PCR法分別檢測內(nèi)皮細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果:1、MTT法檢測不同濃度葡萄糖干預(yù)不同時(shí)間對HUVECs存活率的影響:葡萄糖濃度為33.3 mmol/L的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞48 h后,細(xì)胞的存活率趨于50%,活力顯著降低(P0.01)。經(jīng)Hoechest 33258熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV FITC/PI雙染色法檢測發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖濃度的增加和高糖干預(yù)時(shí)間的延長,凋亡細(xì)胞逐漸增加。當(dāng)用葡萄糖濃度為33.3 mmol/L的高糖培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯增加,而且呈現(xiàn)出致密的濃染,細(xì)胞核的形態(tài)變化明顯,細(xì)胞凋亡率也顯著增加。2、益氣活血通絡(luò)方對內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響:與正常組比較,高濃度的葡萄糖可引起HUVECs內(nèi)IL-1β及TNF-α分泌增加,使這兩個(gè)炎性因子蛋白表達(dá)均增高(P0.05);與模型組比較,各濃度的益氣活血通絡(luò)方含藥血清和西藥硫辛酸可以顯著抑制IL-1β、TNF-α的分泌和蛋白的高表達(dá)(P0.05)。3、益氣活血通絡(luò)方對JNK信號通路的影響:與正常組相比,用高濃度的葡萄糖刺激,可顯著增加HUVECs內(nèi)JNK、P-JNK蛋白的表達(dá),增加JNK m RNA的相對表達(dá)量;用益氣活血通絡(luò)方含藥血清及西藥硫辛酸干預(yù)以后,均可顯著降低細(xì)胞內(nèi)JNK、P-JNK的表達(dá)(P0.01)。益氣活血通絡(luò)方對細(xì)胞凋亡的影響:與正常組比較,濃度為33.3 mmol/L的高糖模型組細(xì)胞存活率顯著降低,內(nèi)皮細(xì)胞的染色質(zhì)向邊緣聚集,細(xì)胞核固縮且呈現(xiàn)出致密的濃染,細(xì)胞的凋亡率明顯升高,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Bax及Caspase-3蛋白和mRNA的表達(dá)顯著增加,Bcl-2蛋白及m RNA的表達(dá)顯著降低(P0.01);用益氣活血通絡(luò)方含藥血清及西藥硫辛酸干預(yù)以后,均可顯著減輕高糖對HUVECs增殖的抑制及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,減少內(nèi)皮細(xì)胞中Bax及Caspase-3的表達(dá),增加Bcl-2的表達(dá)(P0.05,P0.01)。結(jié)論:1、33.3 mmol/L的高濃度葡萄糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48h,可明顯抑制細(xì)胞活性,刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子,激活JNK通路,HUVECs呈現(xiàn)明顯的凋亡特征,細(xì)胞凋亡率顯著升高;2、益氣活血通絡(luò)方可明顯抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)炎性因子的分泌,降低內(nèi)皮細(xì)胞中JNK的表達(dá),對HUVECs的凋亡具有明顯的抑制作用。3、益氣活血通絡(luò)方可減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷,并可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,從而對糖尿病周圍神經(jīng)起到保護(hù)的作用,其機(jī)制可能與JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
【圖文】：

第一部分 高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響3.2 高糖對 HUVECs 凋亡形態(tài)的影響3.2.1 Hoechst33258 熒光染色法觀察不同濃度葡萄糖誘導(dǎo) HUVE48h 后細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化染色結(jié)果顯示，用不同濃度的葡萄糖（5.55mmol/L、11.1mmol/L、22.2 m3.3 mmol/L、44.4mmol/L ）干預(yù) HUVECs 48 h 后，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈彌勻暗淡的藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核普遍呈現(xiàn)藍(lán)白色，呈致密的濃染顯核形態(tài)變化（如圖中的箭頭所示）。隨著葡萄糖濃度的增加，凋亡細(xì)胞的來越多，且呈劑量依賴性地增多。與 5.55mmol/L 組相比，當(dāng)葡萄糖濃度為mol/L 時(shí)，，凋亡細(xì)胞數(shù)增加，核形態(tài)變化明顯。（見圖 1）

圖 2： 33.3 mmol/L 葡萄糖作用不同時(shí)間對 HUVECs 凋亡形態(tài)的的影Fig 2: Effects of 33.3 mmol / L glucose on apoptosis morphology of Hdifferent Time (×100).流式細(xì)胞術(shù)檢測高糖對 HUVECs 凋亡的影響.1AnnexinV FITC/ PI 雙染色法檢測不同濃度的葡萄的影響如圖 3 所示，用不同濃度的葡萄糖（5.55mmol/L、11.1mmol/ mmol/L、 44.4mmol/L ）干預(yù) HUVECs 48 h 后，與 5.55mm度的高糖均能引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，隨著糖濃度的增加，細(xì)
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2596411