【摘要】：背景與目的白花丹素(Plumbagin,5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone;PLB)是一種天然萘醌,于藥用植物白花丹的根部提取。體內(nèi)外研究表明白花丹素具有強(qiáng)大的抗腫瘤、抗炎、止痛以及抗菌活性,白花丹素通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤活性,包括介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬,介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲以及抑制血管生成。但是關(guān)于白花丹素在腫瘤免疫微環(huán)境方面的調(diào)節(jié)作用還沒有相關(guān)報(bào)道。在腫瘤微環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子有利于免疫抑制性細(xì)胞的募集,可以抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答,使得腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。髓系來源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)在促進(jìn)免疫耐受和疾病發(fā)展方面發(fā)揮重要作用,是介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的重要細(xì)胞。本論文利用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究白花丹素是否可以直接調(diào)節(jié)MDSCs的分化和功能,進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境尤其是對免疫抑制性細(xì)胞MDSCs的調(diào)節(jié)作用,從而抑制胰腺癌的發(fā)展,并研究介導(dǎo)此調(diào)節(jié)作用的相關(guān)分子機(jī)制。方法我們利用人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)誘導(dǎo)分化模型研究不同濃度的白花丹素對髓系來源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)分化及功能的影響。然后,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在C57BL/6小鼠胰腺原位上接種小鼠胰腺癌細(xì)胞(Panc02)來構(gòu)建小鼠胰腺癌模型,腹腔給予白花丹素治療后,根據(jù)腫瘤的體積和重量以及產(chǎn)生的腹水體積評估白花丹素的抗瘤活性。利用流式細(xì)胞g.檢測小鼠脾臟、骨髓和腫瘤組織中浸潤的免疫細(xì)胞亞群(CD4~+T、CD8~+T、NKT、γδT)的比例以及髓系來源的免疫抑制性細(xì)胞(MDSCs)比例來探究白花丹素對小鼠腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用。利用流式細(xì)胞g.,RT-PCR以及Transwell等技術(shù)研究分析白花丹素對MDSCs表面標(biāo)記物,相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)以及MDSCs向腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。因?yàn)樵贛DSCs活化和分化的過程中,STAT3作為IL-6的下游效應(yīng)分子發(fā)揮了重要的作用,我們最后通過Western Blotting檢測白花丹素對胰腺癌細(xì)胞和MDSCs中STAT3磷酸化水平的影響。結(jié)果在人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)誘導(dǎo)分化模型中,與陽性對照組相比,白花丹素能夠抑制MDSCs的分化,并具有劑量依賴性。同時(shí),白花丹素抑制ARG1和NO在MDSCs中的表達(dá),并降低了MDSCs抑制效應(yīng)T細(xì)胞的能力,從而促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。在小鼠原位胰腺癌模型中,與溶劑對照組相比,白花丹素能明顯抑制胰腺癌腫瘤的生長,促進(jìn)小鼠腫瘤中具有抗瘤效果的免疫細(xì)胞亞群(CD4~+T、CD8~+T、NKT、γδT)的浸潤并抑制免疫抑制細(xì)胞MDSCs在脾臟、骨髓和腫瘤組織中的募集。我們還發(fā)現(xiàn),白花丹素能夠抑制人的胰腺癌細(xì)胞(Panc-1、BxPC3)和小鼠的胰腺癌細(xì)胞(Panc02)表達(dá)CCL2,并可以通過抑制趨化因子CCL2的表達(dá)進(jìn)一步抑制MDSCs向胰腺癌細(xì)胞Panc-1的遷移,而且白花丹素抑制MDSCs表達(dá)炎性細(xì)胞因子,我們還利用Western Blotting證明了白花丹素可以下調(diào)胰腺癌細(xì)胞和MDSCs中STAT3的磷酸化水平。結(jié)論以上結(jié)果表明,白花丹素可以通過抑制MDSCs的分化,抑制MDSCs對效應(yīng)T細(xì)胞的抑制作用,促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中抗瘤免疫細(xì)胞亞群的浸潤以及抑制免疫抑制性細(xì)胞MDSCs向腫瘤組織的募集發(fā)揮抗胰腺癌的作用。白花丹素可以直接作用于MDSCs或者通過抑制CCL2、IL-6以及其他相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)間接抑制MDSCs的分化和功能。這些結(jié)果提示白花丹素可能是胰腺癌治療的一個(gè)新藥,同時(shí)為胰腺癌免疫治療提供新的科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

SEM 來呈現(xiàn)的，采用 ANOVA 檢驗(yàn)，以 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖由 GraphPad Prism Version 5.0 來完成。流式數(shù)據(jù)使用 FlowJo 7.6.1software(Tree Star，Inc，USA)分析。1.2 結(jié)果1.2.1 白花丹素抑制 MDSCs 細(xì)胞的分化髓系來源的免疫抑制性細(xì)胞 MDSCs 在腫瘤免疫逃逸方面發(fā)揮重要的作用，體外白花丹素對 MDSCs 分化的直接影響尚無相關(guān)報(bào)道。已有研究證明人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）在體外經(jīng)GM-CSF/IL-6 誘導(dǎo)7天后可分化為 MDSCs 細(xì)胞。為了體外研究白花丹素對 MDSCs 的調(diào)控作用，我們利用 CD33 磁珠分選人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的髓系來源的細(xì)胞，GM-CSF/IL-6 和不同濃度的白花丹素共同處理 CD33+細(xì)胞，，7 天后進(jìn)行 CD33、CD11b、HLA-DR 和 CD15 流式抗體標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行 MDSCs 細(xì)胞的檢測。我們首先圈出 CD33+HLA-DRlow/-細(xì)胞群，結(jié)果顯示：CD33+細(xì)胞比例高達(dá) 96.7%，證明我們成功分選出 CD33+細(xì)胞（圖1）

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、白花丹素體外抑制 PBMC 向 MDSCs 的分化劑 量 依 賴性 （ 圖 2 A 、 C ）。 然 后我 們也 對 其 中的 粒 細(xì) 胞樣 MDSCs（CD33+HLA-DRlow/-CD11b+CD15+）進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞群經(jīng)不同濃度的白花丹素共培養(yǎng)后比例也明顯降低，且同樣具有劑量依賴性（圖 2A、B）。這說明，白花丹素能直接調(diào)控 MDSCs 的分化。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2590972