【摘要】：目的:本研究是在中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下,針對(duì)目前扭肚藤治療腹瀉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確、作用機(jī)理不清晰,質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)不能準(zhǔn)確反映臨床療效的問(wèn)題,采用體內(nèi)、體外藥理學(xué)研究方法篩選其有效部位,尋找作用通路及靶點(diǎn);同時(shí),綜合運(yùn)用現(xiàn)代先進(jìn)的分離手段和分析技術(shù)對(duì)扭肚藤有效部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化,獲得有效成分單體,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選具有活性的化合物,并建立與療效相關(guān)的活性成分的質(zhì)量控制方法,同時(shí)考察該成分在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過(guò)程,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)扭肚藤全面而系統(tǒng)的藥效機(jī)理、物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量評(píng)價(jià)研究,為保證臨床用藥質(zhì)量和扭肚藤的合理開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。方法:1.扭肚藤有效部位的提取采用甲醇冷浸提取,提取液回收甲醇并干燥后的浸膏用適量水分散,依次用不同極性的溶劑萃取,分別得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四個(gè)提取部位。2.扭肚藤提取部位的藥效學(xué)研究(1)采用大黃致小鼠腹瀉模型,以小鼠6小時(shí)內(nèi)的稀便率為指標(biāo),觀察扭肚藤提取部位的止瀉作用。(2)采用新斯的明所致小鼠小腸推進(jìn)亢進(jìn)模型,以小腸全長(zhǎng)和炭末推進(jìn)的長(zhǎng)度計(jì)算小腸推進(jìn)率,觀察扭肚藤提取部位對(duì)新斯的明所致小鼠小腸推進(jìn)亢進(jìn)的影響。(3)采用小鼠扭體法,以小鼠扭體次數(shù)為指標(biāo)評(píng)價(jià)扭肚藤提取部位的鎮(zhèn)痛作用。(4)采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法和醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增高法,通過(guò)測(cè)定小鼠耳廓腫脹度和腹腔洗液OD值來(lái)評(píng)價(jià)扭肚藤提取部位的抗炎作用。3.止瀉有效部位作用機(jī)理研究[1](1)選取4個(gè)與腹瀉及炎癥相關(guān)的靶標(biāo)蛋白——BDNF、p38 MAPK、NF-κB p65、p-p38 MAPK作為測(cè)定指標(biāo),取大黃致瀉實(shí)驗(yàn)中各組小鼠的回腸組織作為樣本,采用Western Blotting法對(duì)小鼠回腸組織中的靶標(biāo)蛋白表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。(2)根據(jù)靶標(biāo)蛋白測(cè)定結(jié)果,采用LPS刺激的RAW264.7炎癥細(xì)胞模型對(duì)扭肚藤甲醇提取物、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇提取部位的抗炎活性進(jìn)行篩選。首先采用MTT法檢測(cè)不同濃度提取部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,確定藥物安全濃度后用熒光素酶報(bào)告基因法測(cè)定加入藥物后的含有p-NF-κB-luc質(zhì)粒的NF-κB~(+/+)RAW264.7中的熒光值;同時(shí),用Griess法檢測(cè)野生型RAW264.7(WT)細(xì)胞上清液中NO的釋放量,并用RT-q PCR法測(cè)定細(xì)胞中i NOS m RNA的表達(dá)水平。4.有效部位化學(xué)成分的分離純化采用系統(tǒng)分離法,綜合運(yùn)用MCI Gel、Diaion HP-20、Sephadex LH-20、硅膠等柱層析及制備型高效液相等多種色譜技術(shù)對(duì)扭肚藤的有效部位化學(xué)成分進(jìn)行分離純化,獲得有效成分單體,并結(jié)合ESI-MS、1~H NMR、~(13)C NMR等波譜分析方法對(duì)所得化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。5.有效成分的抗炎活性篩選利用LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7炎癥細(xì)胞模型,考察各待測(cè)有效成分單體對(duì)該細(xì)胞中NO的生成和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。MTT法檢測(cè)不同濃度化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,在化合物的無(wú)毒濃度下,采用Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO的釋放量,同時(shí)測(cè)定LPS誘導(dǎo)的NF-κB~(+/+)RAW 264.7細(xì)胞的熒光值,實(shí)現(xiàn)抗炎活性成分的快速篩選。6.質(zhì)量評(píng)價(jià)研究以咖啡酸甲酯和異綠原酸B兩個(gè)主要活性成分為指標(biāo),采用超高效液相色譜法建立扭肚藤的UPLC指紋圖譜及有效成分的含量測(cè)定方法,并對(duì)所建立的方法進(jìn)行方法學(xué)考察。7.藥代動(dòng)力學(xué)研究采用超高效液相-質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法對(duì)大鼠灌服扭肚藤甲醇提取物后血漿樣品中咖啡酸甲酯和異綠原酸B的濃度進(jìn)行測(cè)定,利用BAPP2.0藥動(dòng)學(xué)軟件對(duì)血藥濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得到各項(xiàng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù),明確該成分被機(jī)體吸收利用的程度。結(jié)果:1.從扭肚藤藥材中提取得到甲醇總提取物及石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇4個(gè)不同極性的提取部位。2.大黃所致小鼠腹瀉動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,扭肚藤的三氯甲烷和乙酸乙酯提取部位能顯著降低小鼠稀便率,具有一定的止瀉作用;扭肚藤對(duì)新斯的明所致小鼠小腸推進(jìn)亢進(jìn)的影響實(shí)驗(yàn)表明,三氯甲烷及乙酸乙酯提取部位的高、低劑量組,石油醚提取部位的高劑量組均能顯著降低新斯的明所致小腸推進(jìn)亢進(jìn)小鼠的小腸推進(jìn)率;鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乙酸乙酯及正丁醇提取部位能顯著降低小鼠扭體次數(shù),具有明顯的鎮(zhèn)痛作用;抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,扭肚藤三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇提取部位及甲醇總提取物均能降低二甲苯所致小鼠的耳廓腫脹度,提示對(duì)急性炎性腫脹具有抑制作用;石油醚、三氯甲烷及正丁醇提取部位在高劑量時(shí)能顯著降低醋酸所致小鼠的毛細(xì)血管通透性,提示對(duì)炎性過(guò)程中毛細(xì)血管通透性增高具有一定的抑制作用。3.扭肚藤三氯甲烷提取部位能顯著降低BDNF、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65在大黃致瀉小鼠模型回腸組織中的表達(dá)量。4.扭肚藤各提取部位濃度低于100μg/m L時(shí),對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯的影響,細(xì)胞存活率在85%以上。三氯甲烷提取部位在無(wú)毒濃度范圍內(nèi)可增加LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及NO生成的抑制率,降低細(xì)胞中致炎因子NO的含量,并降低細(xì)胞中i NOS的m RNA水平的表達(dá)量。5.從扭肚藤的有效部位中分離得到17個(gè)化合物,分別鑒定為原兒茶酸、原兒茶酸甲酯、咖啡酸、咖啡酸甲酯、水楊酸、異香草酸、阿魏酸、咖啡堿、3,6-diisopropylpiperazin-2,5-dione、東莨菪內(nèi)酯、4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲酸、4-hydroxy-4-(3-hydroxy-1-butenyl)-3,5,5-trimethyl-2-Cyclohexen-1-one、3-吲哚甲醛、3,4-O-二咖啡酰基-奎寧酸、3,5-O-二咖啡�；�-奎寧酸、3,4-O-二咖啡�；�-奎寧酸甲酯、3,5-O-二咖啡�；�-奎寧酸甲酯。6.咖啡酸甲酯對(duì)NF-κB的活性和NO的生成具有抑制作用,給藥濃度為12.5,25,50μM時(shí),對(duì)NF-κB活性的抑制率分別為34.65%、33.44%和36.12%,對(duì)NO生成的抑制率分別為39.28%、45.48%和47.89%,且對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯的影響。7.建立了扭肚藤藥材的UPLC指紋圖譜,10批扭肚藤藥材有9批相似度達(dá)到了0.9以上;異綠原酸B和咖啡酸甲酯分別在7.67~38.35μg/m L和9.60~76.8μg/m L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,平均回收率分別為98.61%、99.09%,RSD分別為0.84%、1.25%。8.建立了同時(shí)測(cè)定大鼠口服扭肚藤提取物后,血漿中異綠原酸B和咖啡酸甲酯兩種活性成分的含量測(cè)定方法。方法學(xué)考察表明,血漿中異綠原酸B和咖啡酸甲酯在1~1000ng/m L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,日內(nèi)與日間精密度均少于15%,其準(zhǔn)確性分別在97.54%~107.44%和95.98%~110.73之間,精密度和準(zhǔn)確性較好,提取回收率均大于90%,分別為99.45%~107.93和100.38%~104.52%。異綠原酸B和咖啡酸甲酯在大鼠體內(nèi)的最大血藥濃度C_(max)分別為262.03和575.35 ng/m L,達(dá)峰時(shí)間T_(max)分別為0.25和0.5小時(shí),半衰期T1/2分別為0.75小時(shí)和1.32小時(shí),血藥濃度-時(shí)間曲線下峰面積AUC0~τ分別為290.12和879.85 hng/mL。結(jié)論:動(dòng)物體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,扭肚藤的三氯甲烷和乙酸乙酯部位的止瀉作用較明顯,此外還顯示出一定的抗炎作用;乙酸乙酯及正丁醇部位顯示出明顯的鎮(zhèn)痛作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)合體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證了三氯甲烷提取部位是扭肚藤抗炎止瀉最主要的有效部位,其次是乙酸乙酯提取部位。兩個(gè)有效部位均是通過(guò)調(diào)控NF-κB炎癥通路,抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化,在轉(zhuǎn)錄水平上抑制i NOS等促炎因子的表達(dá),減少NO的釋放從而減輕炎癥反應(yīng)產(chǎn)生止瀉的作用。體外細(xì)胞模型對(duì)有效部位所分離得到的化合物進(jìn)行活性篩選結(jié)果顯示,咖啡酸甲酯具有較好的抗炎活性,異綠原酸B也顯示一定的抗炎活性,是扭肚藤抗炎止瀉的主要物質(zhì)基礎(chǔ),其機(jī)理與抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,減少NO的生成有關(guān)。在此基礎(chǔ)上建立的基于活性成分的扭肚藤的指紋圖譜及含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,能有效地控制扭肚藤的質(zhì)量,保證臨床用藥的有效性。同時(shí),對(duì)活性成分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明,咖啡酸甲酯和異綠原酸B能進(jìn)入體內(nèi)并被吸收利用而后消除。本研究明確了扭肚藤止瀉的作用機(jī)理和物質(zhì)基礎(chǔ),為扭肚藤藥材的深入開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

3.4 干預(yù)胃腸激素的分泌胃腸激素是調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的肽類(lèi)，胃動(dòng)素（MOT）可加強(qiáng)平滑肌收縮，加速胃排空，減少食物在小腸內(nèi)的停留時(shí)間［76］。胃泌素（GAS）等胃腸激素可刺激胃腸道分泌的功能，分泌過(guò)多則可導(dǎo)致腹瀉［77］。生長(zhǎng)抑素（SS）的生理作用包括抑制生長(zhǎng)激素，抑制胃泌素使胃酸及胃蛋白酶減少，抑制胰腺激素分泌等［78］。研究表明，急性腹瀉患者血漿 MOT 水平顯著升高，癥狀緩解后則顯著下降，GAS 在急性重癥腹瀉患者中也有所升高［79］。藥物通過(guò)升高血漿 LDH 水平，同時(shí)降低血漿中的胃動(dòng)素和生長(zhǎng)激素水平，可抑制胃腸運(yùn)動(dòng)，達(dá)到溫脾止瀉的功效［80］。3.5 調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡，保護(hù)腸黏膜腹瀉發(fā)生時(shí)，腺苷酸環(huán)化酶被活化，，細(xì)胞內(nèi)的 ATP 轉(zhuǎn)變成 cAMP，腸黏膜細(xì)胞cAMP 含量迅速增加。Na+-K+-ATP 酶活性改變，使腸黏膜細(xì)胞液中的 K+溢出，Na+，Cl-等水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞腫脹壞死，增加腸腔水分的分泌而導(dǎo)致腹瀉，同時(shí)引起機(jī)體電解質(zhì)紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，水電解質(zhì)紊亂可能與水通道蛋白家族（AQP4 和 AQP8）、圖 1-1 NF-κB 通路作用機(jī)理圖

本論文研究的基本思路和實(shí)施方案
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2590854