【摘要】：目的:本研究是在中醫(yī)藥基礎理論的指導下,針對目前扭肚藤治療腹瀉的藥效物質(zhì)基礎不明確、作用機理不清晰,質(zhì)量檢測指標不能準確反映臨床療效的問題,采用體內(nèi)、體外藥理學研究方法篩選其有效部位,尋找作用通路及靶點;同時,綜合運用現(xiàn)代先進的分離手段和分析技術(shù)對扭肚藤有效部位的化學成分進行分離純化,獲得有效成分單體,在此基礎上進一步篩選具有活性的化合物,并建立與療效相關(guān)的活性成分的質(zhì)量控制方法,同時考察該成分在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程,從而實現(xiàn)對扭肚藤全面而系統(tǒng)的藥效機理、物質(zhì)基礎和質(zhì)量評價研究,為保證臨床用藥質(zhì)量和扭肚藤的合理開發(fā)利用奠定基礎。方法:1.扭肚藤有效部位的提取采用甲醇冷浸提取,提取液回收甲醇并干燥后的浸膏用適量水分散,依次用不同極性的溶劑萃取,分別得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四個提取部位。2.扭肚藤提取部位的藥效學研究(1)采用大黃致小鼠腹瀉模型,以小鼠6小時內(nèi)的稀便率為指標,觀察扭肚藤提取部位的止瀉作用。(2)采用新斯的明所致小鼠小腸推進亢進模型,以小腸全長和炭末推進的長度計算小腸推進率,觀察扭肚藤提取部位對新斯的明所致小鼠小腸推進亢進的影響。(3)采用小鼠扭體法,以小鼠扭體次數(shù)為指標評價扭肚藤提取部位的鎮(zhèn)痛作用。(4)采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法和醋酸致小鼠毛細血管通透性增高法,通過測定小鼠耳廓腫脹度和腹腔洗液OD值來評價扭肚藤提取部位的抗炎作用。3.止瀉有效部位作用機理研究[1](1)選取4個與腹瀉及炎癥相關(guān)的靶標蛋白——BDNF、p38 MAPK、NF-κB p65、p-p38 MAPK作為測定指標,取大黃致瀉實驗中各組小鼠的回腸組織作為樣本,采用Western Blotting法對小鼠回腸組織中的靶標蛋白表達量進行測定。(2)根據(jù)靶標蛋白測定結(jié)果,采用LPS刺激的RAW264.7炎癥細胞模型對扭肚藤甲醇提取物、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇提取部位的抗炎活性進行篩選。首先采用MTT法檢測不同濃度提取部位對RAW264.7細胞生長的影響,確定藥物安全濃度后用熒光素酶報告基因法測定加入藥物后的含有p-NF-κB-luc質(zhì)粒的NF-κB~(+/+)RAW264.7中的熒光值;同時,用Griess法檢測野生型RAW264.7(WT)細胞上清液中NO的釋放量,并用RT-q PCR法測定細胞中i NOS m RNA的表達水平。4.有效部位化學成分的分離純化采用系統(tǒng)分離法,綜合運用MCI Gel、Diaion HP-20、Sephadex LH-20、硅膠等柱層析及制備型高效液相等多種色譜技術(shù)對扭肚藤的有效部位化學成分進行分離純化,獲得有效成分單體,并結(jié)合ESI-MS、1~H NMR、~(13)C NMR等波譜分析方法對所得化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。5.有效成分的抗炎活性篩選利用LPS誘導的RAW 264.7炎癥細胞模型,考察各待測有效成分單體對該細胞中NO的生成和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。MTT法檢測不同濃度化合物對RAW264.7細胞生長的影響,在化合物的無毒濃度下,采用Griess法檢測細胞上清液中NO的釋放量,同時測定LPS誘導的NF-κB~(+/+)RAW 264.7細胞的熒光值,實現(xiàn)抗炎活性成分的快速篩選。6.質(zhì)量評價研究以咖啡酸甲酯和異綠原酸B兩個主要活性成分為指標,采用超高效液相色譜法建立扭肚藤的UPLC指紋圖譜及有效成分的含量測定方法,并對所建立的方法進行方法學考察。7.藥代動力學研究采用超高效液相-質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法對大鼠灌服扭肚藤甲醇提取物后血漿樣品中咖啡酸甲酯和異綠原酸B的濃度進行測定,利用BAPP2.0藥動學軟件對血藥濃度進行數(shù)據(jù)處理,得到各項藥動學參數(shù),明確該成分被機體吸收利用的程度。結(jié)果:1.從扭肚藤藥材中提取得到甲醇總提取物及石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇4個不同極性的提取部位。2.大黃所致小鼠腹瀉動物實驗結(jié)果表明,扭肚藤的三氯甲烷和乙酸乙酯提取部位能顯著降低小鼠稀便率,具有一定的止瀉作用;扭肚藤對新斯的明所致小鼠小腸推進亢進的影響實驗表明,三氯甲烷及乙酸乙酯提取部位的高、低劑量組,石油醚提取部位的高劑量組均能顯著降低新斯的明所致小腸推進亢進小鼠的小腸推進率;鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果表明,乙酸乙酯及正丁醇提取部位能顯著降低小鼠扭體次數(shù),具有明顯的鎮(zhèn)痛作用;抗炎實驗結(jié)果表明,扭肚藤三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇提取部位及甲醇總提取物均能降低二甲苯所致小鼠的耳廓腫脹度,提示對急性炎性腫脹具有抑制作用;石油醚、三氯甲烷及正丁醇提取部位在高劑量時能顯著降低醋酸所致小鼠的毛細血管通透性,提示對炎性過程中毛細血管通透性增高具有一定的抑制作用。3.扭肚藤三氯甲烷提取部位能顯著降低BDNF、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65在大黃致瀉小鼠模型回腸組織中的表達量。4.扭肚藤各提取部位濃度低于100μg/m L時,對RAW264.7細胞的生長無明顯的影響,細胞存活率在85%以上。三氯甲烷提取部位在無毒濃度范圍內(nèi)可增加LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及NO生成的抑制率,降低細胞中致炎因子NO的含量,并降低細胞中i NOS的m RNA水平的表達量。5.從扭肚藤的有效部位中分離得到17個化合物,分別鑒定為原兒茶酸、原兒茶酸甲酯、咖啡酸、咖啡酸甲酯、水楊酸、異香草酸、阿魏酸、咖啡堿、3,6-diisopropylpiperazin-2,5-dione、東莨菪內(nèi)酯、4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲酸、4-hydroxy-4-(3-hydroxy-1-butenyl)-3,5,5-trimethyl-2-Cyclohexen-1-one、3-吲哚甲醛、3,4-O-二咖啡�；�-奎寧酸、3,5-O-二咖啡�；�-奎寧酸、3,4-O-二咖啡�；�-奎寧酸甲酯、3,5-O-二咖啡�；�-奎寧酸甲酯。6.咖啡酸甲酯對NF-κB的活性和NO的生成具有抑制作用,給藥濃度為12.5,25,50μM時,對NF-κB活性的抑制率分別為34.65%、33.44%和36.12%,對NO生成的抑制率分別為39.28%、45.48%和47.89%,且對RAW264.7細胞的生長無明顯的影響。7.建立了扭肚藤藥材的UPLC指紋圖譜,10批扭肚藤藥材有9批相似度達到了0.9以上;異綠原酸B和咖啡酸甲酯分別在7.67~38.35μg/m L和9.60~76.8μg/m L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,平均回收率分別為98.61%、99.09%,RSD分別為0.84%、1.25%。8.建立了同時測定大鼠口服扭肚藤提取物后,血漿中異綠原酸B和咖啡酸甲酯兩種活性成分的含量測定方法。方法學考察表明,血漿中異綠原酸B和咖啡酸甲酯在1~1000ng/m L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,日內(nèi)與日間精密度均少于15%,其準確性分別在97.54%~107.44%和95.98%~110.73之間,精密度和準確性較好,提取回收率均大于90%,分別為99.45%~107.93和100.38%~104.52%。異綠原酸B和咖啡酸甲酯在大鼠體內(nèi)的最大血藥濃度C_(max)分別為262.03和575.35 ng/m L,達峰時間T_(max)分別為0.25和0.5小時,半衰期T1/2分別為0.75小時和1.32小時,血藥濃度-時間曲線下峰面積AUC0~τ分別為290.12和879.85 hng/mL。結(jié)論:動物體內(nèi)藥效學實驗研究結(jié)果表明,扭肚藤的三氯甲烷和乙酸乙酯部位的止瀉作用較明顯,此外還顯示出一定的抗炎作用;乙酸乙酯及正丁醇部位顯示出明顯的鎮(zhèn)痛作用。體外細胞實驗結(jié)合體內(nèi)藥效學實驗研究進一步驗證了三氯甲烷提取部位是扭肚藤抗炎止瀉最主要的有效部位,其次是乙酸乙酯提取部位。兩個有效部位均是通過調(diào)控NF-κB炎癥通路,抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化,在轉(zhuǎn)錄水平上抑制i NOS等促炎因子的表達,減少NO的釋放從而減輕炎癥反應產(chǎn)生止瀉的作用。體外細胞模型對有效部位所分離得到的化合物進行活性篩選結(jié)果顯示,咖啡酸甲酯具有較好的抗炎活性,異綠原酸B也顯示一定的抗炎活性,是扭肚藤抗炎止瀉的主要物質(zhì)基礎,其機理與抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,減少NO的生成有關(guān)。在此基礎上建立的基于活性成分的扭肚藤的指紋圖譜及含量測定方法簡單、準確、重復性好,能有效地控制扭肚藤的質(zhì)量,保證臨床用藥的有效性。同時,對活性成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究表明,咖啡酸甲酯和異綠原酸B能進入體內(nèi)并被吸收利用而后消除。本研究明確了扭肚藤止瀉的作用機理和物質(zhì)基礎,為扭肚藤藥材的深入開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。
【圖文】：

3.4 干預胃腸激素的分泌胃腸激素是調(diào)節(jié)胃腸運動的肽類，胃動素（MOT）可加強平滑肌收縮，加速胃排空，減少食物在小腸內(nèi)的停留時間［76］。胃泌素（GAS）等胃腸激素可刺激胃腸道分泌的功能，分泌過多則可導致腹瀉［77］。生長抑素（SS）的生理作用包括抑制生長激素，抑制胃泌素使胃酸及胃蛋白酶減少，抑制胰腺激素分泌等［78］。研究表明，急性腹瀉患者血漿 MOT 水平顯著升高，癥狀緩解后則顯著下降，GAS 在急性重癥腹瀉患者中也有所升高［79］。藥物通過升高血漿 LDH 水平，同時降低血漿中的胃動素和生長激素水平，可抑制胃腸運動，達到溫脾止瀉的功效［80］。3.5 調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡，保護腸黏膜腹瀉發(fā)生時，腺苷酸環(huán)化酶被活化，，細胞內(nèi)的 ATP 轉(zhuǎn)變成 cAMP，腸黏膜細胞cAMP 含量迅速增加。Na+-K+-ATP 酶活性改變，使腸黏膜細胞液中的 K+溢出，Na+，Cl-等水分進入細胞內(nèi)使細胞腫脹壞死，增加腸腔水分的分泌而導致腹瀉，同時引起機體電解質(zhì)紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，水電解質(zhì)紊亂可能與水通道蛋白家族（AQP4 和 AQP8）、圖 1-1 NF-κB 通路作用機理圖

本論文研究的基本思路和實施方案
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙暉;半夏瀉心湯活性成分與止瀉作用的關(guān)系[J];國外醫(yī)學(中醫(yī)中藥分冊);2000年06期

2 劉曉玲;崔奇珍;李燕舞;趙想法;;康腸靈抗炎、鎮(zhèn)痛、止瀉作用研究[J];中藥藥理與臨床;2006年02期

3 溫慧萍;費儉;童應鵬;;畬藥柳葉蠟梅止瀉作用的初步探討[J];江西中醫(yī)藥;2012年01期

4 譚大琦,李秋華,嚴春海,胡明,洪文,竺稽能;廣樸止瀉液止瀉作用的實驗研究[J];時珍國藥研究;1993年04期

5 包翠屏,許啟泰,雷玉河,杜鋼軍;閎草止瀉作用的實驗研究[J];中草藥;1994年08期

6 徐如堂;半夏瀉心湯止瀉作用的實驗研究[J];國外醫(yī)學(中醫(yī)中藥分冊);1997年02期

7 張信岳;繆云萍;李欽;程敏;葉小弟;鄭高利;;腸瀉停膠囊止瀉作用研究[J];中國現(xiàn)代應用藥學;2005年06期

8 陳存標,陳秀榕;干姜止瀉作用的藥理實驗[J];海峽藥學;1994年03期

9 鄭興中，倪峰;止瀉定膠囊的體內(nèi)抗菌和止瀉作用[J];中藥新藥與臨床藥理;1994年01期

10 ;半夏瀉心湯止瀉作用的研究[J];江西中醫(yī)學院學報;1998年04期

相關(guān)會議論文 前2條

1 賴岳曉;劉佩沂;王嵩;田素英;;腸腹寧顆粒及其主要成分總皂苷鎮(zhèn)痛與止瀉作用研究[A];共鑄醫(yī)藥學術(shù)新文明——2012年廣東省藥師周大會論文集[C];2012年

2 孔令鋒;李書淵;;扭肚藤的生藥研究[A];中華中醫(yī)藥學會第九屆中藥鑒定學術(shù)會議論文集——祝賀中華中醫(yī)藥學會中藥鑒定分會成立二十周年[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 昭和;飲泡茶時間有講究[N];江蘇科技報;2000年

2 興隆縣衛(wèi)校門診部 左玉品;當心五更瀉[N];河北科技報;2002年

相關(guān)博士學位論文 前2條

1 胥愛麗;扭肚藤止瀉作用機理及物質(zhì)基礎研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2017年

2 高長玉;四神丸方源考析及止瀉作用的藥效與機理研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學;2005年

相關(guān)碩士學位論文 前8條

1 田作明;羊蹄葉水提取物止瀉作用及其機制的研究[D];沈陽藥科大學;2002年

2 劉素芳;野罌粟水煎劑對番瀉葉致瀉小鼠止瀉作用的機理研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2007年

3 王薔;芎麻湯有效提取部位的譜效關(guān)系研究[D];湖南中醫(yī)藥大學;2009年

4 許舒瑜;金牡感冒片質(zhì)量控制研究[D];福建中醫(yī)藥大學;2015年

5 付運星;抗犬瘟熱病毒中藥化學成分篩選及異綠原酸A對MDCK細胞TLR3信號通路的影響[D];吉林大學;2016年

6 程麗;中藥成分綠原酸和異綠原酸的敏化熒光與分析方法研究[D];河北師范大學;2017年

7 楊敏;苦丁茶中異綠原酸的提取純化工藝及其抗類風濕關(guān)節(jié)炎的藥效學研究[D];湖北中醫(yī)藥大學;2017年

8 曾潔;異綠原酸A大鼠體內(nèi)吸收特性與代謝動力學研究[D];廣東藥學院;2014年

本文編號：2590854