【摘要】：本論文共四章,第一章論述了米團(tuán)花(Leucosceptrum canum)二萜/二倍半萜合酶初步催化機(jī)制的研究;第二章闡述了“六合一”(LHY)工程大腸桿菌代謝物及抗細(xì)菌活性的研究;第三章闡述了竹黃菌(Shiraia bambusicola)和竹紅菌(Hpocrellabambusae)化學(xué)成分和生物活性的比較研究;第四章綜述了竹紅菌的化學(xué)成分、生物活性以及竹紅菌素的給藥研究進(jìn)展。第一章米團(tuán)花萜類合酶初步催化機(jī)制研究二倍半萜(sesterterpenoids)是五個(gè)異戊二烯結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成分子骨架的一類天然產(chǎn)物,由二倍半萜合酶催化香葉基法尼基焦磷酸酯(geranylfarnesyl diphosphate,GFPP)衍生而來。前期實(shí)驗(yàn)室從米團(tuán)花腺毛中克隆并功能鑒定了一個(gè)雙功能二萜/二倍半萜合酶,但它的活性中心以及如何調(diào)控兩種萜類產(chǎn)物合成的機(jī)制尚未知曉。在此基礎(chǔ)上,本論文通過對LcTPS25進(jìn)行定點(diǎn)突變,成功構(gòu)建了 11個(gè)突變酶,并對突變酶進(jìn)行了體內(nèi)酶活實(shí)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)突變酶(LcTPS25-277Y/W,-277Y/A,-415I/S,-429W/G,-447T/A,-505N/A和-509V/F)的二倍半萜和二萜合酶活性均顯著降低,其中突變酶LcTPS25-277Y/w完全失去活性;突變酶LcTPS25-411L/A的活性變化小,LcTPS25-516F/A的二倍半萜合酶活性顯著增強(qiáng),而LcTPS25-419M/G和-512R/A的二倍半萜合酶活性有一定的增強(qiáng)。另外,本論文研究了LcTPS25在植物體內(nèi)的功能。構(gòu)建了LcTPS25和GFPPS瞬時(shí)表達(dá)載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法實(shí)現(xiàn)目的基因在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果顯示LcTPS25在煙草瞬時(shí)表達(dá)體系的酶活產(chǎn)物與其在大腸桿菌表達(dá)體系的產(chǎn)物一致,表明LcTPS25的功能可能不受表達(dá)宿主的影響。本論文揭示了LcTPS25的初步催化機(jī)制,為深入研究植物二倍半萜合酶的催化機(jī)制奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為二倍半萜化合物的生物合成及代謝工程改造提供了科學(xué)依據(jù)。第二章“六合一”工程大腸桿菌代謝物與抗細(xì)菌活性研究線蟲(nematode)是一類病原微生物,植物寄生線蟲對全球農(nóng)作物造成重大危害。課題組前期發(fā)現(xiàn),細(xì)菌型聚酮合酶-非核糖體肽合酶(PKS-NRPS)雜合生源次級代謝產(chǎn)物thermolides有顯著毒殺線蟲活性,并構(gòu)建了 1株高溫菌PKS-NRPS基因簇、谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素P450酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、水解酶和烯酰還原酶在大腸桿菌BL21中共表達(dá)的菌株“六合一”(Lhy)。本論文利用多種柱層析對該工程大腸桿菌發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取浸膏進(jìn)行了化學(xué)成分的分離與純化,從中分離鑒定了 15個(gè)化合物,包括7個(gè)氯霉素的�；〈苌�(glhy9～glhy15)。測試glhy10～glhy15的抗細(xì)菌活性,發(fā)現(xiàn)其活性均比氯霉素低,表明細(xì)菌可以通過�；饔脤⒙让顾刈兂啥拘暂^低的氯霉素衍生物,為細(xì)菌抵抗氯霉素的作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。第三章竹黃菌和竹紅菌化學(xué)成分及細(xì)胞毒活性的比較研究竹黃菌和竹紅菌是我國民間用于治療胃病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)中藥,但它們的區(qū)別少有報(bào)道。為研究二者的差異,本論文對兩種真菌子座的甲醇提取物進(jìn)行了跟蹤分離,從竹黃菌和竹紅菌中分別分離鑒定了 14個(gè)和8個(gè)化合物,兩者相同的成分為竹紅菌甲素(gSb1)、竹紅菌乙素(gSb2)、竹紅菌丙素(gSb3)、過氧麥角甾醇(gHb6)、3,6,8-三羥基-1-甲基口山酮(gHb7)和3,8-二羥基-6-甲氧基-1-甲基口山酮(gHb8),其中g(shù)Sb1～gSb3是兩種真菌主要的相同成分;二者主要差異成分為11,11'-二去氧沃替西林(gSb4)和灰黃霉素(gHb5)。首次從竹黃菌中分離到麥角甾-7,22E-二烯-3β,5α,6β-三醇(gSb8)和麥角甾-7,22E-二烯-2β,3α,9α-三醇(gSb10),并首次從竹紅菌中分離到竹紅菌丁素(gHb4)、gHb5、gHb7和gHb8�；钚院Y選發(fā)現(xiàn),gSb4對人肺腺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞有很強(qiáng)細(xì)胞毒活性,gSb1活性較強(qiáng),而gHb4活性微弱,表明竹黃菌可能比竹紅菌更具有抗腫瘤應(yīng)用前景,為二者的開發(fā)利用提供了參考價(jià)值。第四章竹紅菌的研究進(jìn)展本章綜述了截止2019年3月國內(nèi)外報(bào)道的竹紅菌的化學(xué)成分、生物活性和竹紅菌素的給要研究。
【圖文】：

圖１．２篩選的氨基酸殘基的位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ邋１．２邋Ｓｉｔｅ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｓｃｒｅｅｎｅｄ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ逡逑

圖１．３Ｂ）突逡逑變酶對酶活產(chǎn)物的影響較小，揭示了邋４１１位亮氨酸突變成Ｒ基更小的丙氨酸后對逡逑ＬｃＴＰＳ２５活性的影響較其它突變酶小
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2590853