【摘要】：背景和目的骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種慢性退行性疾病,其關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨都經(jīng)歷了復(fù)雜的的重塑過程。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大、凋亡,軟骨退變。同時(shí)由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的軟骨下骨丟失,導(dǎo)致表層關(guān)節(jié)軟骨支撐缺失,加速其退變。氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)是一種天然小分子化合物,深入探索其對(duì)于OA軟退變及軟骨下骨重塑的作用,有望為OA的治療提供新的藥物選擇,具有重要的價(jià)值。內(nèi)容和方法1.Real-time PCR研究OMT對(duì)于軟骨細(xì)胞炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的變化。ELISA檢測(cè)炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌情況。并通過離體軟骨組織培養(yǎng),研究OMT對(duì)于離體培養(yǎng)軟骨組織退變的挽救作用。2.研究OMT在調(diào)節(jié)成骨、破骨細(xì)胞分化成熟中的作用。TRAP染色和F-Actin環(huán)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)破骨細(xì)胞分化情況。Real-time PCR和western blot研究OMT對(duì)于破骨細(xì)胞分化標(biāo)致基因表達(dá)的影響。3.研究OMT對(duì)于NF-κB信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路的激活的影響。4.通過構(gòu)建ACLT骨關(guān)節(jié)炎模型,應(yīng)用組織形態(tài)學(xué)和生物學(xué)分析手段,深入研究腹腔注射OMT對(duì)ACLT小鼠的骨丟失的保護(hù)作用及對(duì)于軟骨退變的延緩作用。結(jié)果1.Real-time PCR結(jié)果表明,OMT預(yù)處理可以顯著降低由脂多糖誘發(fā)的炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生。ELISA進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。離體培養(yǎng)軟骨組織的免疫組化染色結(jié)果顯示,OMT顯著抑制軟骨組織釋放蛋白聚糖,對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有顯著的保護(hù)作用。2.TRAP染色和F-Actin染色結(jié)果顯示OMT可以抑制破骨細(xì)胞的分化成熟。Real-time PCR和western blot結(jié)果顯示OMT顯著抑制破骨分化標(biāo)致基因的表達(dá)。OMT對(duì)于BMSC成骨分化無明顯影響。3.Western blot、免疫熒光和核質(zhì)分離結(jié)果均顯示OMT可以顯著抑制軟骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞中的NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活。4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,軟骨番紅-固綠染色結(jié)果顯示OMT腹腔注射可以顯著延緩小鼠關(guān)節(jié)軟骨磨損。TUNLE染色結(jié)果顯示,OMT可以顯著減少軟骨層細(xì)胞凋亡。免疫組化結(jié)果顯示OMT可以顯著抑制關(guān)節(jié)軟骨層MMP9和MMP13的表達(dá)及NF-κB信號(hào)通路的激活。骨顯微CT掃描結(jié)果顯示OMT可以顯著減輕OA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的丟失,TRAP染色顯示OMT腹腔注射顯著抑制了ACLT小鼠軟骨下板(SCP)和軟骨下小梁骨(STB)中顯示了增多的TRAP陽性多核破骨細(xì)胞。結(jié)論1.氧化苦參堿可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性退變,同時(shí)在體條件下抑制OA軟骨退變。2.氧化苦參堿抑制破骨分化的同時(shí)對(duì)成骨分化沒有明顯影響,在體條件下可以有效延緩OA軟骨下骨的丟失。3.氧化苦參堿可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK信號(hào)通路,進(jìn)而行使抑制軟骨退變和破骨分化的作用。
【圖文】：

圖 2. 氧化苦參堿抑制 LPS 所誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)和分解代謝。（A）定量 PCR 檢測(cè)炎癥因子和機(jī)制金屬蛋白酶的表達(dá)變化。（B）ELISA 檢測(cè)炎癥因子和機(jī)制金屬蛋白酶的表達(dá)變化。(*) P < 0.05 。Fig.2 Treatment with OMT protects chondrocytes from LPS-induced inflammation andcatabolism. (A) Pro-inflammatory cytokines, including IL-6, -8, -10 and TNF-α, were assessed byreal-time PCR. (B) The expression levels of MMP2, MMP9, MMP13, IL-6 and TNF-α wereinvestigated using ELISA. Data are shown as the means ±S.D of triplicate independent experiments.(*) P < 0.05 compared to the control group.1.4.3 氧化苦參堿延緩離體培養(yǎng)軟骨的退變按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)離體培養(yǎng)的軟骨組織塊施以不同的處理，對(duì)照組不做任何處理，退變組加入 10 μg/ml 的 LPS 促進(jìn)軟骨退變，處理組加入 1 mg/ml 的氧化苦參堿聯(lián)合 10 μg/ml 的 LPS，對(duì)切片行 H&E、Safranin O 染色檢測(cè)，同時(shí)免疫組化檢測(cè)軟骨組織特異性標(biāo)志物 Collagen II 的表達(dá)水平（圖 3.A）。在此基礎(chǔ)上，對(duì)軟骨Safranin O 和 Collagen II 的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（圖 3. B），結(jié)果證實(shí)組件具有顯著差異（P<0.05），說明氧化苦參堿可以顯著延緩離體軟骨組織的退變。

圖 3. 氧化苦參堿延緩 LPS 所誘導(dǎo)的離體軟骨組織退變。（A）a-f：軟骨組織 H&E 染色；g-l：軟骨組織 Safranin O 染色；m-r：軟骨組織 Collagen II 免疫組化染色（B）軟骨組織 SafraninO 染色強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)，（C）軟骨組織 Collagen II 表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)。(*) P < 0.05 。Fig. 3. OMT attenuates human articular cartilage degradation in an ex vivo model. (A) Humancartilage explants were stained with H&E (a-f) and Safranin O (g-l) Immunohistochemical stainingfor collagen II (m-r). Scale bar, 100 μm. (B) The overall Safranin O staining intensity of theexplants was assessed. (C) The panels show the quantification of collagen II immunohistochemicalstaining.1.4.4 氧化苦參堿抑制軟骨組織蛋白聚糖的釋放軟骨糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又稱為粘多糖，是體內(nèi)最為豐富的異源多聚糖。糖胺多糖是一種未分叉的負(fù)電荷性長(zhǎng)鏈多聚糖，由重復(fù)的二糖單位，包括六碳糖或己糖醛酸，鏈接到己糖胺上而成。糖胺多糖與核心蛋白共價(jià)相聯(lián)，構(gòu)成蛋白多糖，，成為細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。在軟骨退變時(shí)，組織釋放 GAG，故檢測(cè)上清液中的 GAG 的含量可以間接反應(yīng)出軟骨退變水平。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在第 7 天與第 14 天培養(yǎng)模型中，氧化苦參堿均可以顯著抑制軟骨組織塊中的 GAG 的釋放（圖 4）。證實(shí)氧化苦參堿可以顯著抑制軟骨
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2590581