【摘要】：目的:研究梔子與兩種烏頭對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠藥理活性以及西紅花酸脂質(zhì)體制備。方法:1.梔子中總環(huán)烯醚萜苷及總西紅花苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠保護(hù)作用研究以HPD_(100)大孔吸附樹脂分離梔子(Gardenia jasminoides Ellis)中總環(huán)烯醚萜苷(TIG)和總西紅花苷(TC)部位,采用UHPLC-DAD-QTOF-MS測定這兩個部位主要成分及其含量,并通過紫外可見分光光度法(UV-Vis)測定TIG和TC中總環(huán)烯醚萜苷和總西紅花苷的含量。通過AA大鼠模型研究TIG和TC抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)作用及機制。將雄性SD大鼠30只分為5組:空白組(control)、模型組(AA)、TIG組(160 mg/kg/d)、TC組(160 mg/kg/d)、DS組(5 mg/kg/d),每組6只。于大鼠右足趾底部注射0.1 m L弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,FCA)造模,給藥14天后,拍照觀察大鼠右足趾底部腫脹度,電子游標(biāo)卡尺測量大鼠踝關(guān)節(jié)直徑,以X-ray檢測大鼠踝關(guān)節(jié)狀態(tài),HE染色檢測大鼠踝關(guān)節(jié)、脾臟、胸腺病理變化,采用免疫組化染色檢測踝關(guān)節(jié)滑膜腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達(dá)。2.西紅花酸脂質(zhì)體制備與單因素考察將西紅花苷水解為西紅花酸,采用UHPLC-DAD-QTOF-MS鑒定化合物結(jié)構(gòu),并測定西紅花酸含量。薄膜分散結(jié)合超聲法制備西紅花酸脂質(zhì)體,激光粒度儀測定粒徑、粒徑分布和zeta電位,UV-Vis測定包封率(EE%)和載藥量(DL%)。通過單因素設(shè)計優(yōu)化西紅花酸脂質(zhì)體制備條件,考察超聲時間、水合時間、水合溫度、大豆卵磷脂與膽固醇比例、大豆卵磷脂與西紅花酸比例對脂質(zhì)體平均粒徑、EE%和DL%的影響,以及十八胺用量對脂質(zhì)體表面電位、平均粒徑、EE%、DL%的影響。3.玉龍烏頭和黃草烏對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠保護(hù)作用研究以酸提堿沉法和甲醇超聲法分別制備玉龍烏頭(Aconitum stapfianum Hand-Mazz.)和黃草烏(Aconitum vilmorinianum Kom.)有效部位。急性毒性研究得出玉龍烏頭總堿(total alkaloids of Aconitum stapfianum Hand-Mazz.,TAA)和黃草烏甲醇提取物(methanol extract of Aconitum vilmorinianum Kom.,MEA)的口服半數(shù)致死量(LD_(50))。按藥理方法計算TAA和MEA的有效劑量,然后通過AA大鼠模型研究兩種烏頭抗RA作用及機制。將36只雄性SD大鼠隨機分為6組:空白組(control)、模型組(AA)、TAA低劑量組(1.5 mg/kg/d)、TAA高劑量組(3.0 mg/kg/d)、MEA低劑量組(5 mg/kg/d)、MEA高劑量組(10 mg/kg/d),每組6只。于大鼠右足趾底部注射0.1mL FCA造模,電子游標(biāo)卡尺測量大鼠踝關(guān)節(jié)直徑,X-ray檢測大鼠踝關(guān)節(jié)狀態(tài),HE染色檢測大鼠踝關(guān)節(jié)、脾臟、胸腺的病理變化,免疫組化染色檢測踝關(guān)節(jié)滑膜中TNF-α、TGF-β1表達(dá)。結(jié)果:1.梔子中總環(huán)烯醚萜苷及總西紅花苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠保護(hù)作用研究測定結(jié)果顯示,梔子TIG中梔子苷含量為53.6%,TIG中西紅花苷-1、西紅花苷-2和西紅花苷-3含量分別為37.2%、3.3%和4.6%。UV-Vis測定TIG中總環(huán)烯醚萜含量為58.2%,TC中總西紅花苷含量為54.7%。在AA大鼠藥理研究中,與模型組相比,大鼠踝關(guān)節(jié)直徑變化和X-ray檢測結(jié)果顯示,TIG(160 mg/kg/d)顯著降低AA大鼠踝關(guān)節(jié)直徑(P(27)0.05),緩解踝關(guān)節(jié)軟組織腫脹和骨質(zhì)損傷(P(27)0.05);組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,TIG(160 mg/kg/d)明顯緩解大鼠踝關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤,滑膜襯里層細(xì)胞增生等病理變化(P(27)0.01),并減輕脾臟和胸腺充血腫脹;免疫組化結(jié)果顯示,TIG(160mg/kg/d)顯著減少大鼠滑膜中TNF-α和TGF-β1表達(dá)(P(27)0.01)。TC(160 mg/kg/d)給藥也可緩解上述病理變化,但是在X-ray檢測評分和TGF-β1蛋白表達(dá)指標(biāo)中,TC組與模型組比較沒有顯著性差異(P0.05)。2.西紅花酸脂質(zhì)體制備與單因素考察UHPLC-DAD-QTOF-MS測定西紅花酸含量為73.67%,薄膜分散結(jié)合超聲法制備西紅花酸脂質(zhì)體平均粒徑為240±8.6 nm、PDI值0.216±0.03、zeta電位為+24.1±3.3 mv、EE%為95.5±3.2%、DL%為26.1±1.2%。西紅花酸脂質(zhì)體最優(yōu)制備條件:十八胺用量為40mg/100mL、超聲時間為40 min、水合時間2 h左右、水合溫度40℃、大豆卵磷脂與膽固醇比例為6:1、大豆卵磷脂與西紅花酸比例為6:1。3.玉龍烏頭和黃草烏對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠保護(hù)作用研究TAA的口服LD_(50)是43.002 mg/kg,MEA的口服LD_(50)是150.960 mg/kg;根據(jù)計算確定TAA的給藥劑量為1.5 mg/kg/d、3.0 mg/kg/d;MEA的給藥劑量為5 mg/kg/d、10 mg/kg/d。在AA大鼠藥理研究中,與模型組相比,MEA(5、10 mg/kg/d)給藥均顯著降低AA大鼠踝關(guān)節(jié)直徑(P(27)0.05,P(27)0.01);踝關(guān)節(jié)X-ray攝片和評分顯示,MEA(5、10 mg/kg/d)給藥均明顯緩解AA大鼠關(guān)節(jié)軟組織腫脹,骨質(zhì)損傷(P(27)0.01);踝關(guān)節(jié)HE染色結(jié)果和病理評分顯示,MEA(5、10 mg/kg/d)給藥均明顯改善AA大鼠踝關(guān)節(jié)各種病理變化(P(27)0.01);脾臟和胸腺HE染色結(jié)果顯示,MEA(5、10 mg/kg/d)給藥均明顯改善AA大鼠脾臟和胸腺充血腫脹;免疫組化結(jié)果顯示,MEA(5、10 mg/kg/d)給藥均顯著降低滑膜TNF-α和TGF-β1表達(dá)(P(27)0.01)。TAA(1.5 mg/kg/d)給藥也可改善上述病理變化,但各指標(biāo)均沒有顯著性差異(P0.05)。TAA(3.0 mg/kg/d)給藥顯著降低大鼠踝關(guān)節(jié)直徑(P(27)0.05),并緩解上述病理變化(P(27)0.01)。結(jié)論:1.研究首次闡明梔子中總環(huán)烯醚萜苷和總西紅花苷對AA關(guān)節(jié)炎大鼠均有保護(hù)作用,但總環(huán)烯醚萜苷的藥效更加顯著�？紤]到梔子中總環(huán)烯醚萜苷(梔子苷)的含量更高,今后應(yīng)采用總環(huán)烯醚萜苷(梔子苷)含量測定作為梔子抗炎藥效評價指標(biāo)。2.首次采用薄膜水化結(jié)合超聲法制備西紅花酸脂質(zhì)體,該脂質(zhì)體具有平均粒徑小、PDI值低、EE%和DL%高等優(yōu)勢。并且通過單因素設(shè)計優(yōu)化西紅花酸脂質(zhì)體制備條件,確定西紅花酸脂質(zhì)制備的十八胺用量、超聲時間、水合時間、水合溫度、大豆卵磷脂與膽固醇比例、大豆卵磷脂與西紅花酸比例。3.首次探索研究黃草烏和玉龍烏頭毒理,確定這兩種烏頭的口服LD_(50),并闡明黃草烏和玉龍烏頭對AA關(guān)節(jié)炎大鼠均有保護(hù)作用,均是藥效顯著的抗RA中藥。
【圖文】：

圖 1 梔子苷和西紅花苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of geniposide and crocins如上所述，梔子中除環(huán)烯醚萜苷(梔子苷)外，另一類含量較高的化合物為西紅花rocin)，西紅花苷屬天然類胡蘿卜素，這類化合物是由西紅花酸和葡萄糖或龍膽構(gòu)成的一系列糖酯類化合物，主要由西紅花苷-1(crocin-1)、西紅花苷-2(crocin-2)花苷-3(crocin-3)和西紅花苷-4(crocin-4)等母核相同的化合物組成(圖 1)。西紅花苷是天然食用色素，而且具有顯著抗炎藥理活性。Yang 等[25]研究顯示，西紅花苷善失血性休克(HS)患者炎癥驅(qū)動帶來的組織損傷，在 HS 手術(shù)大鼠中，西紅花苷著降低血清中促炎性細(xì)胞因子 TNF-α 和 IL-6 水平，增加抗炎性細(xì)胞因子 IL-1。Yosri 等[26]研究顯示，西紅花苷能調(diào)節(jié) IL-4/IL-13 信號傳導(dǎo)來抑制炎癥，并改鼠變應(yīng)性氣道哮喘。此外，還有研究顯示，crocin 能抑制體外 IL-1β 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)細(xì)胞 MMPS 活化，而且在體內(nèi)兔關(guān)節(jié)炎模型中抑制軟骨炎癥浸潤[27]。以上數(shù)據(jù)，西紅花苷具有明顯抗炎作用，也可能是梔子和西紅花中主要抗炎活性成分之一

圖 1 TIG 和 TC 的 LC-MS 圖譜Fig.1 LC-MS chromatograms of TIG and TC3.2 UV-Vis 測定由圖 1 中可以看出，除了這四種成分外，還有與梔子苷和西紅花苷色譜峰類似的其它小色譜峰，光譜圖與主成分峰類似，顯示 TIG 中除梔子苷外還有其它環(huán)烯醚萜苷衍生物，TC 中除了 crocin-1、crocin-2、crocin-3 外還有其它西紅花苷衍生物。因此，為進(jìn)一步反映 TIG 和 TC 中總苷的含量，本研究同時采用 UV-Vis 測定兩個部位總苷含量。UV-Vis 雖然不能具體分離檢測 TIG 和 TC 中各單體成分，，但在分析中分別使用梔子苷和西紅花苷-1 對照品即可分別測定出兩個部位中總環(huán)烯醚萜苷和總西紅花苷含量。本課題以對照品梔子苷和 crocin-1 為參照，用紫外可見分光光度計測定 TIG和 TC 中總環(huán)烯醚萜苷和總西紅花苷含量(圖 2)，分別在 238 nm 和 440 nm 處測定 TIG和 TC 的吸光度 A 值，計算出 TIG 中總環(huán)烯醚萜苷的含量為 58.2%，TC 中總西紅花
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2590168