【摘要】：目的:通過體內(nèi)實驗,觀察糖尿病狀態(tài)下牙周組織的改變,并以青蒿琥酯(Artesunate,ART)進行干預(yù),檢測青蒿琥酯對糖尿病大鼠牙周組織炎癥反應(yīng)及骨代謝的影響。同時,通過體外實驗,檢測ART對糖尿病狀態(tài)骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)增殖及成骨分化的影響。探討ART在伴糖尿病牙周病防治中的應(yīng)用前景與價值。方法:(1)體內(nèi)實驗:選取健康SD大鼠40只,體重200~220 g,隨機分成5組:健康對照組、糖尿病對照組(DM組)、糖尿病ART 50 mg/kg用藥組(DM+ART 50 mg/kg組)、糖尿病ART 100 mg/kg用藥組(DM+ART100 mg/kg組)和糖尿病胰島素用藥組(DM+Insulin組),每組8只。DM組、DM+ART 50 mg/kg組、DM+ART 100 mg/kg組和DM+Insulin組大鼠經(jīng)60 mg/kg鏈脲佐菌素腹腔注射誘導形成糖尿病,正常組注射等比例生理鹽水,以空腹血糖大于16.7 mmol/L作為誘導成功的糖尿病大鼠模型血糖參數(shù)標準。DM+ART 50 mg/kg組和DM+ART 100 mg/kg組分別給予50 mg/kg、100 mg/kg ART灌喂,對照組和DM組給予等量生理鹽水灌喂,DM+Insulin組給予6 U/kg胰島素皮下注射,每日給藥1次,共給藥4周。期間每日觀察大鼠一般狀況,每周測量空腹血糖和體重。第4周末處死大鼠,收集上頜牙槽骨、牙周組織及胰腺組織。采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察組織病理學改變;免疫組化法檢測牙齦IL-1β、TNF-α和上頜牙槽骨ALP、OCN表達情況;熒光定量PCR法檢測上頜牙槽骨ALP、OCN、RUNX2表達情況。(2)體外實驗:選取4周齡SD大鼠,分離脛骨和股骨,采用全骨髓貼壁法分離,并采用免疫熒光法檢測CD34、CD44表達情況進行鑒定,獲得BMSCs。將BMSCs置于高糖培養(yǎng)基和不同濃度ART干預(yù)的環(huán)境中,實驗分組為:對照組(含5.5 mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基)、12 mM高糖組、12 mM葡萄糖+ART 1μM用藥組(12 mM Glc+1μM ART組)、12 mM葡萄糖+ART 3μM用藥組(12 mM Glc+3μM ART組)、25 mM高糖組、25 mM葡萄糖+ART 1μM用藥組(25 mM Glc+1μM ART組)、25 mM葡萄糖+ART3μM用藥組(25 mM Glc+3μM ART組)。采用CCK8法檢測各組BMSCs增殖情況;采用堿性磷酸酶活性實驗檢測各組BMSCs堿性磷酸酶活性;采用熒光定量PCR檢測各組BMSCs的ALP、OCN、RUNX2 mRNA表達情況。結(jié)果:1、口腔牙周狀況觀察,糖尿病大鼠口腔衛(wèi)生狀況差,可見較多食物殘留,游離齦和齦乳頭多呈暗紅色,偶見牙齦腫脹,質(zhì)地松軟,易出血,其中DM組大鼠癥狀最嚴重,DM+ART 50 mg/kg組、DM+ART 100 mg/kg組組和DM+Insulin組癥狀較輕,各組大鼠均未見明顯的牙松動和牙缺失。對照組大鼠口腔衛(wèi)生狀況良好,牙齦呈淺紅色,未見牙松動和牙缺失。2、DM組大鼠牙齦上皮增厚,棘層增生,上皮釘突伸長呈水滴狀或融合成網(wǎng)狀�？梢婟l溝上皮增生,形成釘突,周圍大量炎癥細胞浸潤。結(jié)締組織排列紊亂,可見網(wǎng)狀纖維被破壞,且結(jié)締組織內(nèi)血管增生、擴張、充血,周圍見大量炎癥細胞浸潤。松質(zhì)骨可見明顯病理改變,骨小梁變細、彎曲、排列紊亂,骨小梁連續(xù)性被破壞,常見有破骨細胞吸收骨質(zhì)所形成的骨吸收陷窩。DM+ART 50 mg/kg組、DM+ART 100 mg/kg組、DM+Insulin組和對照組大鼠牙齦上皮角化明顯,棘層細胞排列緊密,結(jié)締組織內(nèi)網(wǎng)狀纖維排列整齊,少見炎癥細胞浸潤。DM+ART 50 mg/kg組、DM+ART 100mg/kg組和DM+Insulin組骨松質(zhì)區(qū)骨小梁排列較整齊,但骨小梁較細,破骨細胞少見。對照組骨松質(zhì)區(qū)骨小梁粗大,排列整齊,相互連接構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),骨小梁間距較小,破骨細胞少見。3、免疫組織法檢測牙齦組織中IL-1β、TNF-α表達情況,DM組牙齦中IL-1β、TNF-α表達最高,與其他組比較差異具有顯著性意義(P0.05);DM+ART 50 mg/kg組、DM+ART 100 mg/kg組、DM+Insulin組和對照組表達水平相近,差異無顯著性意義(P0.05)4、免疫組織法檢測上頜牙槽骨中ALP、OCN表達情況,DM組上頜牙槽骨中ALP、OCN表達最低,與其他組比較差異具有顯著性意義(P0.05);DM+ART 50 mg/kg組、DM+ART 100 mg/kg組和DM+Insulin組表達水平相近,差異無顯著性意義(P0.05);對照組上頜牙槽骨表達最高,與其他組比差異具有顯著性意義(P0.05)。5、熒光定量PCR法檢測上頜牙槽骨ALP、OCN、RUNX2 mRNA表達情況。DM組上頜牙槽骨中ALP、OCN、RUNX2 mRNA表達最低,與其他組比較差異具有顯著性意義(P0.05);DM+ART 50 mg/kg組、DM+ART100 mg/kg組和DM+Insulin組表達水平相近,差異無顯著性意義(P0.05);對照組表達最高,與其他組比差異具有顯著性意義(P0.05)。6、CCK8法檢測ART及高糖對BMSCs增殖的影響:1μM和3μM ART對BMSCs不產(chǎn)生細胞毒性作用,12 mM和25 mM高糖環(huán)境會抑制BMSCs的增殖,經(jīng)1μM和3μM ART干預(yù)后,BMSCs增殖能力得到部分恢復,但仍低于對照組。7、BMSCs堿性磷酸酶活性實驗:對照組堿性磷酸酶活性最高,與其他組比較差異具有顯著性意義(P0.05),12 mM高糖組和25 mM高糖組最低,1μM和3μM ART干預(yù)后堿性磷酸酶活性上升,但仍比對照組低。8、熒光定量PCR法檢測BMSCs的ALP、OCN、RUNX2 mRNA表達情況:對照組ALP、OCN、RUNX2表達最高,與其他組比較差異具有顯著性意義(P0.05);12 mM高糖組和25 mM高糖組表達最低,1μM和3μM ART干預(yù)后表達水平上升,但仍比對照組低。結(jié)論:(1)體內(nèi)實驗:糖尿病大鼠牙周組織存在慢性炎癥,且頜骨成骨能力受損,但并未發(fā)展成牙周炎。ART可對糖尿病大鼠牙齦炎癥發(fā)揮顯著的抗炎作用,同時部分恢復糖尿病大鼠頜骨受損的成骨能力。(2)體外實驗:高糖環(huán)境下BMSCs增殖和成骨分化能力受損。ART干預(yù)后,高糖環(huán)境下BMSCs的增殖和成骨分化能力得到部分恢復,但仍低于正常環(huán)境BMSCs。
【圖文】：

組、DM+ART 50 mg/kg 組、DM+ART 100 mg/kg 組和 DM經(jīng) 1%鏈脲佐菌素腹腔注射后狀態(tài)良好，進食正常，精神狀 周末、2 周末檢測空腹血糖，均達到糖尿病判定標準。成模鼠逐漸表現(xiàn)出多飲多食多尿癥狀，并有精神萎靡、活動減少狀，同時體重并無明顯增長，甚至體重減輕。對照組大鼠飲滿，好動，體重穩(wěn)定上升�？谇谎乐軤顩r觀察，糖尿病大鼠差，可見較多食物殘留，游離齦和齦乳頭多呈暗紅色，偶見地松軟，，易出血，其中 DM 組大鼠癥狀最嚴重，DM+ART +ART 100 mg/kg 組和 DM+Insulin 組癥狀較輕，但各組大牙松動和牙缺失。對照組大鼠口腔衛(wèi)生狀況良好，牙齦呈淺松動和牙缺失。

圖 1-2 各組大鼠體重變化情況Fig. 1-2 Changes in body weight of rats in each group腺 HE 染色觀察結(jié)果脲佐菌素對動物的胰島 β 細胞具有選擇性破壞的作用，從而糖尿病。因此，本實驗從各組隨機抽取 3 只大鼠胰腺組織，觀察其病理學改變以判斷糖尿病模型建立情況。對照組大鼠正常，胰島形態(tài)正常，未見明顯病理改變。DM 組、DM+ART +ART 100 mg/kg 組和 DM+Insulin 組大鼠胰腺內(nèi)外分泌部萎少，且萎縮變小，胰島內(nèi) β 細胞數(shù)量少，排列紊亂。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2590121