【摘要】：研究背景急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是一種嚴重臨床病癥,在急癥病例中大約有1/5的病人會罹患這一疾病。在住院病人中急性腎損傷成為普遍而且危險的加速患者死亡的因素,它可以由藥物毒性及膿毒癥所引起。膿毒癥合并AKI預(yù)示著一個可怕的臨床情況,其相關(guān)的醫(yī)院死亡率可高達70%。多年來,膿毒癥引起的器官損傷和其他有害并發(fā)癥被認為是由一種過度炎癥反應(yīng)誘發(fā)的細胞因子風暴所致,它因感染性病原體或生理性應(yīng)激而觸發(fā)。多個利用大鼠離體和在體實驗研究表明,通過血慮廣泛吸附減少炎性細胞因子可以防止腎和肝損傷,提高細菌清除率和平均動脈壓,降低細胞凋亡和腎小管細胞損傷,并提高總體生存率。有大量研究聚焦于明確哪些是與常見膿毒癥綜合征相關(guān)的特異性細胞因子。盡管進行了大量研究,但膿毒癥和AKI臨床表現(xiàn)之間基本的病理生理機制關(guān)系還沒有完全清楚。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁外層成分,有研究證明它是導致膿毒癥急性腎損傷的主要誘發(fā)因素。LPS誘導的膿毒癥有多種炎性因子參與介導。在小鼠中LPS引起導致急性腎損傷的細胞炎性因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和白介素1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)在急性腎損傷的病理改變進程中扮演了重要角色。NF-κ B是一種高度表達的轉(zhuǎn)錄因子,常在細胞應(yīng)激反應(yīng)中被激活,誘導腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-6和IL-8的合成和釋放。雖然從腎臟局部產(chǎn)生炎癥因子對全身的細胞因子水平的總體貢獻是未知的,但由核因子-κκB(nucler factor-κκB,NF-κκB)介導的信號轉(zhuǎn)導過程確實可在分離的原代大鼠腎小管上皮細胞發(fā)生。Toll樣受體-4(Toll-like receptors 4,TLR-4)在移植腎缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury,IRI)的發(fā)病機制中起著重要作用。TLR-4不僅對外源微生物基序有反應(yīng),而且能識別應(yīng)激和壞死細胞釋放的相關(guān)分子,同時能識別內(nèi)源性大分子的降解產(chǎn)物。在腎缺血再灌注損傷過程中,TLR-4的上調(diào)見于腎小管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞,這是由內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(如高遷移率組合染色體蛋白1)的大量酶誘導的。TLR-4的激活促進炎癥介質(zhì)的釋放,促進白細胞遷移和浸潤,激活先天和獲得性免疫系統(tǒng),并增強腎纖維化,在臨床上常常導致嚴重的不良后果,而抑制這些炎癥因子可以減輕腎組織的損傷程度。有研究者對TLR-4基因敲除小鼠,移植能夠表達TLR-4的異體腎的實驗表明,相對于局部TLR-4整體的表達合成可能更為重要。NF-κ B直接抑制藥物如methyl-2-acetamidoacrylate(一種丙酮酸乙酯類似物,丙酮酸乙酯和煙堿型乙酰膽堿)能降低小鼠血清細胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10γ),改善已有感染癥狀A(yù)KI小鼠的臨床特征,減輕腎功能損傷的程度。因此早期采取針對性抗炎治療可以有效改善腎功能。NOD樣受體蛋3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)隸屬于模式識別受體PRR(patern recognition receptor,PRR)這一大類蛋白受體家族,它是其中一個亞家族的成員,接頭蛋白可以與活化的Nod樣受體蛋白產(chǎn)生相互作用,進而激活半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1),形成一種稱為“炎癥小體(inflammasome)”的蛋白復合物,作為免疫防御的第一步識別感染并啟動病原體清除和組織修復過程。炎癥小體是參與這些過程的最重要的復合物之一它通過ASC(包含一個分子銜接的凋亡相關(guān)微粒蛋白,apoptosis-associated speck-like protein containing,CARD)招募pro-caspase-1,然后將細胞因子前體pro-IL-1 β和pro-IL-18切割成成熟的IL-1β和IL-18。活化后的炎癥小體還通過調(diào)節(jié)Gasdermin D(GSDMD)的N端區(qū)域在細胞膜中形成孔道,促進稱為細胞焦亡的一種“炎性形式”的細胞死亡。存在于腎臟內(nèi)的單核網(wǎng)狀吞噬細胞可以為IL-1 β、IL-18產(chǎn)生以及NLRP3的合成提供必要的物質(zhì)條件,有研究顯示NLRP3基因敲除的小鼠與野生型小鼠相比,在慢性腎損傷時IL-1β、IL-18和Caspase-1蛋白的含量降低,腎小管的損傷減輕。多位學者的多項研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病相關(guān)腎損傷中NLRP3炎性小體及NF-κB的表達升高,NLRP3-Caspase-1-IL-1 β/IL-18這一通路在此現(xiàn)象中有重要作用�？傊�,TNF-α,IL-1β,IL-6,NLRP3,TLR-4等物質(zhì)在急性腎損傷發(fā)生中扮演了重要的角色。傳統(tǒng)中草藥是研究開發(fā)新型藥物的重要資源,在這一問題上眾所周知的青蒿素、紫杉醇等的發(fā)現(xiàn)就是一強有力的證明。金絲桃苷是一種黃酮類化合物來源于杜鵑花科、衛(wèi)矛科和藤黃科植物,它對哺乳動物表現(xiàn)有多種生物學效應(yīng),如抗炎作用便是其中之一,有報道它能抑制LPS導致的大鼠腹膜巨噬細胞的亞硝酸鹽生成,也能抑制LβS導致的小鼠急性肝損傷,在Sahreen S等人的研究表明金絲桃苷通過抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子生成保護CC14(carbon tetrachloride)誘導的急性肝損傷。金絲桃苷還被發(fā)現(xiàn)有對心臟缺血再灌注損傷的保護作用。Lee S等用金絲桃苷作為工具藥研究了p44/p42 MAPK(絲裂原活化蛋白激酶,mitogen-activated protein kinase)、p38 MAPK 和JNK(c-Jun氨基末端激酶,c-Jun N-terminal kinase)在大鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的作用發(fā)現(xiàn),金絲桃苷可使p44/p42 MAPK、p38 MAPK和JNK表達抑制,進而降低 iNOS(Inhibitory nitric oxide synthase)表達,抑制NO合成,引起的結(jié)果是炎癥反應(yīng)的減輕。Kim SJ等在實驗研究中發(fā)現(xiàn)金絲桃苷不但能夠使NF-κ B的活化程度降低而且也可以減少I κ B-α的降解,從而說明金絲桃苷在機體的調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)活動中具有正面的作用。Hu J等實驗發(fā)現(xiàn)中腦導水管周圍灰質(zhì)中的NR2B(N-methyl-D-aspartate Receptors 2B)和NMDA(N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate)受體可被金絲桃苷調(diào)節(jié),由于這兩個受體和炎癥疼痛密切相關(guān),而產(chǎn)生長時間消炎止痛效果。上述對NF-κκB、IL-1β、IL-18和Caspase-1等的研究,均側(cè)重于腎缺血再灌注損傷的機理,而膿毒癥所致的急性腎功能損傷也是臨床遇到的難題之一,對于明確其發(fā)病機制,探索有效的防治方法也具有重要的臨床意義。金絲桃苷具有肝臟、心臟等器官有保護作用,但其對LPS所致腎損傷是否也有保護作用尚不明確,因此在本實驗中我們試圖探究金絲桃苷對LPS所致膿毒癥小鼠AKI是否也有保護效應(yīng),如果這種保護效應(yīng)被證實,則進一步研究這種保護效應(yīng)可能的機制。研究目的1研究金絲桃苷對LPS所致急性腎損傷小鼠TNF-α、IL-6和IL-1 β的影響。2研究金絲桃苷對LPS所致急性腎損傷小鼠血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐的影響。3研究金絲桃苷對LPS所致急性腎損傷小鼠TLR4,NF-κ B和NLRP3表達的影響。研究方法1動物分組選擇60只BABL/c雄性小鼠,6-8周齡,由濱州醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物的使用符合醫(yī)學動物實驗倫理學要求。小鼠急性腎損傷模型的制備方法,小鼠腹腔進行注射15mg/kg的脂多糖,注射脂多糖后24小時采集小鼠血液,處死小鼠后摘取腎臟組織。60只BABL/c小鼠隨機分為5組,每組各12只。組1作為陰性對照,只進行和實驗藥物同容量的PBS(磷酸緩沖鹽溶液,phosphate buffer saline)液注射。組2作為LPS組,腹腔注射15mg/kg的LPS 50 u1,組3、組4、組5作為金絲桃苷+LPS組,組3給予金絲桃苷25mg/kg和LPS50 ul,組4給予金絲桃苷50mg/kg和LPS50 ul,組5予金絲桃苷100mg/kg和LPS50 ul,金絲桃苷在給予LPS后1h應(yīng)用。2腎組織HE染色腎組織取材后,用含10%福爾馬林的PBS液固定。固定好的腎組織修剪成大小合適的方塊包埋于石蠟中。石蠟切片后(切片厚度為5微米)用H-E染色法染色,最后將制備好的腎組織切片放置于顯微鏡下觀察形態(tài)學的變化。3血尿素氮和肌酐測定各組小鼠用上述相應(yīng)的藥物進行處理24小時后,收集每只小鼠的血液。使用自動分析儀分析測量本實驗采集血清尿素氮和肌酐水平。操作方法根據(jù)設(shè)備的說明書進行。4酶聯(lián)免疫吸附試驗來自不同組的腎組織在冰上用PBS勻漿,然后在4℃以12000轉(zhuǎn)/分鐘,離心40分鐘。隨后,收集上清液,測定腫瘤壞死因子-α、IL-6和IL-1β的表達。根據(jù)廠家說明書,采用ELISA試劑盒檢測炎性細胞因子水平。5 Western blot分析用蛋白提取液進行腎組織勻漿,以1OOOOg離心10分鐘,用BCA蛋白試劑盒對上清液蛋白質(zhì)濃度進行測定。在10%SDS-PAGE上蛋白質(zhì)分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上,用5%無脂干奶粉阻斷后,在4℃時將膜與原抗體孵育24小時。TBS/Tween20洗滌三次后,在室溫下用HRP結(jié)合的二次抗體對膜探測lh。最后,用ECL化學發(fā)光試劑盒((ECL-plus,Thermo Scientific,USA)對膜進行可視化標記處理。6統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來表示,用單因素方差分析(Dunnetts t-test)和雙尾T檢驗進行統(tǒng)計學分析析。檢驗標準以P0.05認為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1金絲桃苷對LPS導致的腎損傷病理形態(tài)學改變的影響為研究金絲桃苷的保護作用,我們用HE染色法檢測對比正常腎組織和損傷腎組織的病理改變。對照組顯示正常腎組織的形態(tài)學表現(xiàn),在脂多糖組腎組織有嚴重的損傷表現(xiàn),包括腎小管上皮細胞脫落,刷狀緣微絨毛減少,腎單位的凋亡,而用金絲桃苷處理后無論腎小管上皮細胞脫落程度,還是刷狀緣微絨毛減少的數(shù)量,以及腎單位的凋亡情況鏡下觀察均有明顯改善。2金絲桃苷減輕AKI腎功能紊亂實驗中以反映腎小球濾過損害程度經(jīng)典可靠指標BUN和肌酐水平評估腎功能,和對照組相比,脂多糖組BUN和肌酐水平明顯升高,而在用金絲桃苷處理后,這種由脂多糖導致的BUN和肌酐的升高可被金絲桃苷抑制,并且這種抑制有劑量依賴性(25,50,100 mg/kg)。3金絲桃苷抑制細胞因子的表達為研究金絲桃苷的抗炎效應(yīng),我們用ELISA法檢測了炎性因子TNF-α,IL-6和IL-1 β的水平。和對照組相比,脂多糖組TNF-α,IL-6和IL-1 β的水平明顯升高,而和脂多糖組相比較金絲桃苷處理組TNF-α,IL-6和IL-1 β的水平又明顯減低。4金絲桃苷抑制脂多糖誘導的TLR4的表達和NF-κ B的活化TLR4是脂多糖誘導的急性腎損傷的一個重要因素,為了研究金絲桃苷的抗炎機制,我們考察了金絲桃苷對TLR4信號通路的影響。本實驗結(jié)果表明脂多糖可顯著上調(diào)TLR4的表達及激活NF-κ B,而金絲桃苷能顯著抑制TLR4的表達,并且,金絲桃苷處理可劑量依賴的抑制NF-κB和IKBα的磷酸化。5金絲桃苷抑制脂多糖誘導的NLRP3信號通路為進一步研究金絲桃苷的抗炎機制,我們對金絲桃苷對NLRP3信號通路的影響進行了研究。結(jié)果和對照組相比,脂多糖組NLRP3,caspase-1和ASC的表達明顯升高。而和脂多糖組相比金絲桃苷處理組NLRP3,caspase-1和ASC的表達受到明顯抑制。結(jié)論在本實驗條件下可得如下結(jié)論:①金絲桃苷對LPS所致的急性腎損傷有保護作用;②金絲桃苷的保護作用可能是通過抑制LPS導致的TNF-α,IL-6和IL-1β的合成,并且抑制LPS導致的TLR4表達和NF-κB的活化;③另外,金絲桃苷處理可劑量依賴的抑制NLRP3信號通路。總之,金絲桃苷可能通過抑制TLR4和NLRP3通路減輕LPS所致的急性腎損傷。
【圖文】：

邐山東大學博士學位論文邐逡逑（ＴＮＦ－ａ邋ａ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－Ｙ和ＩＬ－１０邋丫）［２＿］，改善已有感染性ＡＫＩ的小鼠臨床逡逑特征［１＿２］。逡逑如下示意圖１標示了由腫瘤壞死因子－ａ，高遷移率（ＨＭＧ）邋Ｂ１，與多病菌所逡逑致膿毒癥激活的ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ轉(zhuǎn)錄因子途徑。ＬＰＳ結(jié)合Ｔｏｌｌ樣受體４邋（ＴＬＲ－４）是依賴逡逑于它與循環(huán)脂多糖結(jié)合蛋白ＬＢＰ和隨后結(jié)合的膜ＣＤ１４邋［２３］。這種逡逑ＬＰＳ－ＬＢＰ－ＣＤ１４－ＴＬＲ－４復雜結(jié)構(gòu)固定在各種細胞內(nèi)（特別是在腎近端小管的頂端逡逑刷狀緣），在那里啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。在人腎小管上皮細胞中脂多糖可上逡逑調(diào)ＣＤ１４基因表達［２４］［２５］，而在小鼠腎間質(zhì)和管狀上皮細胞是通過ＴＮＦ－ａ上調(diào)ＣＤ１４逡逑ＰｏｆｙｉｎｉｃｒｏｂＬａｌ邐—逡逑ｌＰＳ邋丨…一逡逑

邐山東大學博士學位論文邐逡逑水平都顯著反應(yīng)性增加；３）通過樹脂吸附法去濾除膿毒血漿炎癥介質(zhì)，這些效逡逑應(yīng)信號和細胞凋亡水平可以減少［９：。事實上，在培養(yǎng)的腎小管上皮細胞暴露于嚴逡逑重燒傷和感染性ＡＫＩ患者血漿中時，可觀察到細胞凋亡［５８：。逡逑所謂的死亡受體如Ｆａｓ、ＴＮＦ受體（ＴＮＦＲ１），或腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導逡逑（ＴＲＡＩＬ）受體結(jié)合細胞外配體激活下游激活物半胱天冬酶［５４］。這個過程通常是逡逑通過ＦＡＤＤ（Ｆａｓ相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白）受體介導，并最終激活效應(yīng)分子ｃａｓｐａｓｅ－３。逡逑通過細胞應(yīng)激產(chǎn)生在細胞內(nèi)途徑：活性氧（ＲＯＳ）、一氧化氮、ＡＴＰ減少、細胞／逡逑細胞基質(zhì)擾動［＇５９］。在應(yīng)對這些應(yīng)激時，通過Ｂｃｌ－２家族的特異性的ＢＨ３蛋白活化，逡逑（＋）邋ＴＮＦ－ａ逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2589161