【摘要】：目的本研究通過運用永久性結扎雙側頸總動脈法建立慢性腦缺血損傷的大鼠模型,觀察精制清開靈對模型大鼠空間學習記憶能力及對海馬神經元形態(tài)的影響,從行為學和組織形態(tài)學做出初步藥效評價。在此基礎上重點研究精制清開靈對模型大鼠海馬CA1區(qū)腦源性神經營養(yǎng)因子BDNF及受體TrkB、神經生長因子NGF、神經營養(yǎng)因子NT-3表達的影響,以期部分闡明精制清開靈抗慢性腦缺血損傷的作用機制。方法(1)采用對實驗大鼠永久性結扎雙側頸總動脈的方法制作慢性腦缺血大鼠模型。實驗動物分為正常組(Sham)、模型組(Model)、多奈哌齊組(Donepezi)、精制清開靈組(RQKL)。大鼠造模后給予藥物連續(xù)灌胃60天。通過Morris水迷宮行為學實驗,對各組進行定位航行和空間探索測試,實驗共進行5天。水迷宮測試結束后,隨機抽取各組的部分實驗大鼠進行灌注固定取材,制成腦組織海馬石蠟切片,進行HE染色,光鏡下觀察海馬神經元的形態(tài)變化。(2)采用免疫組化方法、免疫印跡分析方法測定海馬CA1 區(qū)腦源性神經營養(yǎng)因子BDNF及其受體TrkB的蛋白表達變化,用Real Time PCR方法測定BDNFmRNA、TrkBmRNA的表達變化,分析精制清開靈對BDNF、TrkB的表達影響。(3)運用免疫組化方法、酶聯免疫吸附實驗法測定海馬CA1區(qū)神經營養(yǎng)因子NT-3、神經生長因子NGF蛋白表達,用Real Time PCR方法測定NGFmRNA、NT-3 mRNA的表達變化,分析精制清開靈對NT-3、NGF的表達影響。結果(1)慢性腦缺血模型大鼠在進行永久雙側頸總動脈結扎后出現一些行為學和組織形態(tài)學的病態(tài)改變。在水迷宮測試中,慢性腦缺血模型大鼠表現出明顯的學習記憶障礙。與Sham組大鼠相比,Model組大鼠逃避潛伏期的降低趨勢比較平緩,逃避潛伏期時間明顯延長(P0.05);Model組大鼠穿越平臺次數及穿越原平臺象限次數均顯著減少(P0.01),具有統計學意義;經HE染色可見Model組海馬CA1區(qū)神經元數量較Sham組明顯減少,錐體細胞排列松散紊亂,胞體縮小,細胞核固縮或溶解,細胞間距變大,少部分神經細胞出現水腫,呈現出一些較明顯的缺血性病理改變。(2)精制清開靈藥物連續(xù)灌胃60天后,經水迷宮定位航行實驗結果顯示,與Model組大鼠相比,RQKL組大鼠逃避潛伏期下降趨勢較明顯,逃避潛伏時間明顯縮短(P0.05);空間探索實驗結果顯示,與Model組大鼠相比,RQKL組大鼠穿越平臺次數及穿越原平臺象限次數均明顯上升(P0.05),具有統計學意義。經HE染色可見RQKL組大鼠神經元數量較Model組增多,神經細胞丟失減少,細胞排列較為有序,細胞邊界較清晰,固縮現象減少,細胞數和形態(tài)接近Sham組。(3)精制清開靈干預下海馬CA1區(qū)腦源性神經營養(yǎng)因子BDNF及其受體TrkB的蛋白水平及BDNFmRNA、TrkBmRNA的表達均有明顯變化。采用免疫組化方法測定顯示,與Model組相比,RQKL組BDNF、TrkB在海馬CA1區(qū)椎體細胞棕黃色陽性表達均明顯增多(分別為0.48±0.06,P0.05;0.39±0.05,P0.05)。采用免疫印跡分析法測定結果顯示,與Model組相比,RQKL組BDNF、TrkB蛋白含量均明顯提高(分別為0.49±0.07,P0.05;0.41±0.09,P0.01)。運用RT-PCR法檢測結果顯示,與Model組相比,RQKL組BDNFmRNA、TrkBmRNA表達水平明顯升高(分別為0.79±0.10,P0.05;0.71±0.04,P0.05)。(4)精制清開靈干預下海馬CA1區(qū)神經營養(yǎng)因子NT-3、神經生長因子NGF蛋白含量及NT-3mRNA、NGFmRNA的表達均有明顯改變。免疫組化實驗結果顯示,與Model組相比,RQKL組神經營養(yǎng)因子NT-3、神經生長因子NGF在海馬CA1區(qū)的陽性細胞表達均有上升(分別為0.58±0.04,P0.01;0.33±0.04,P0.05)。采用酶聯免疫吸附方法檢測結果顯示,與Model組相比,RQKL組海馬中NT-3、NGF蛋白含量明顯增多(分別為157.24±16.58,P0.01;122.05±14.34,P0.05)。運用Real Time PCR法檢測結果顯示,與Model組相比,RQKL組NT-3mRNA、NGFmRNA表達水平明顯升高(分別為1.35±0.11,P0.01;0.84±0.08 P0.05)。結論(1)精制清開靈可在一定程度上改善慢性腦缺血大鼠空間學習記憶的能力,減輕慢性腦缺血引起的大鼠海馬神經元的損傷。(2)精制清開靈可上調海馬CA1區(qū)腦源性神經營養(yǎng)因子BDNF及其受體TrkB的蛋白水平及mRNA的表達,說明其促進BDNF及其受體TrkB的有效結合,從而發(fā)揮對神經元的保護作用,有可能是精制清開靈抗慢性腦缺血損傷的作用途徑之一。(3)精制清開靈可上調海馬CA1區(qū)神經營養(yǎng)因子NT-3、神經生長因子NGF蛋白水平及mRNA的表達,在一定程度上發(fā)揮對神經元的保護作用,有可能是精制清開靈抗慢性腦缺血損傷的作用途徑之一。
【圖文】：

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本文編號：2589032