【摘要】：肉蓯蓉(Cistanches Herba)為名貴中藥,有較高的藥用和食用價值,被譽為“沙漠人參”。近年來,針對肉蓯蓉的化學成分定性、定量研究不斷深入,但主要集中于苯乙醇苷類化學成分研究上,尚未見對其大極性和中、小極性成分的同步定性、定量分析的報道。苯乙醇苷類化合物為肉蓯蓉中主要活性成分,結構中含有多個不穩(wěn)定基團,易在分析過程中降解而影響分析結果的準確性,因此,需要建立可靠的分析手段對肉蓯蓉進行精確質量分析。以肉蓯蓉總苷為原料的蓯蓉總苷膠囊在臨床中廣泛應用于髓海不足證造成的輕、中度血管性癡呆,但體內(nèi)藥效物質及作用機理尚未明確。因此,本論文針對以上研究缺陷,對肉蓯蓉的體內(nèi)外化學成分進行系統(tǒng)研究,并利用藥物代謝組學方法探索肉蓯蓉抗血管性癡呆的體內(nèi)藥效物質和作用機制,以期提高肉蓯蓉質量分析方法,為肉蓯蓉的臨床應用及相關藥物的開發(fā)提供參考。具體研究內(nèi)容和結果如下:1.肉蓯蓉化學成分的全面定性定量分析建立加壓溶劑提取模塊(PLE),實現(xiàn)肉蓯蓉樣品快速微量(約1mg)提取,通過LC-IT-TOF-MS分析肉蓯蓉超聲提取和加壓溶劑提取方法的提取效率,驗證了加壓溶劑提取模塊能夠實現(xiàn)化學成分的高效提取。利用IT-TOF-MS高分辨質譜豐富的多級質譜信息,系統(tǒng)總結了肉蓯蓉主要成分苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類化合物的質譜裂解規(guī)律,并鑒定肉蓯蓉中79個化學成分。同時,將加壓溶劑提取模塊與高效液相色譜在線連接,構建PLE-TFC-HPLC-DAD系統(tǒng)實現(xiàn)了肉蓯蓉中8個苯乙醇苷類成分的快速同步定量分析,方法學考察結果顯示該方法能夠實現(xiàn)肉蓯蓉的快速、準確定量。PLE系統(tǒng)的建立和應用,減少了分析過程中樣品和有機溶劑的用量,節(jié)約了制備樣品的時間,降低了不穩(wěn)定成分在處理過程中降解的可能性,實現(xiàn)了肉蓯蓉樣品直接、快速的在線分析,同時也為中藥和生物樣品等固體復雜基質的分析提供了可靠、快速的綠色分析方法。為闡明肉蓯蓉體內(nèi)代謝物,首先對肉蓯蓉化學成分組進行深入解析。采用Qtrap-MS質譜的多種掃描模式,如預測多反應監(jiān)測模式(pMRM)、中性丟失掃描(NL)、母離子掃描(Prec)、增強子離子掃描(EPI)和增強質譜掃描(EMS)等,利用高分辨質譜研究的質譜裂解規(guī)律,建立基于特征碎片的NL162Da、146Da等中性丟失掃描方法和Prec m/z 161、m/z 145等母離子掃描方法,對苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類等主要化學類型進行深度挖掘,并基于HMDB等數(shù)據(jù)庫建立pMRM方法檢測初級代謝產(chǎn)物。綜上,共檢測到肉蓯蓉中513個化學成分,基本闡明了肉蓯蓉化學成分組。采用反相色譜-親水作用色譜-質譜聯(lián)用系統(tǒng)(RPLC-HILIC-MS/MS)對肉蓯蓉中的大、中和小極性27個成分,如氨基酸、核苷、苯乙醇苷、糖類等,進行了同步定量分析。利用在線質譜參數(shù)優(yōu)化策略對肉蓯蓉中含量高的松果菊苷、毛蕊花糖苷、甘露糖醇質譜響應進行選擇性抑制,并采用高靈敏度的sMRM模式保證低含量化學成分的檢出。方法學考察結果表明該系統(tǒng)能夠擴展檢測線性范圍、增強對極性化合物的保留,適用于肉蓯蓉中極性跨度大、含量差異大的多成分同步含量測定,也為其他中藥的多成分全面質量控制提供可靠的方法。2.肉蓯蓉的體內(nèi)化學成分分析基于亞結構拆分和結構簡化策略,采用LC-MS技術對酪醇、羥基酪醇、咖啡酸、紅景天苷、肉蓯蓉苷F、脫羧基迷迭香酸、毛蕊花糖苷、松果菊苷以及肉蓯蓉的體內(nèi)代謝過程進行系統(tǒng)研究。發(fā)現(xiàn)苯乙醇苷、苯丙素苷以及含酯鍵的化合物灌胃大鼠后酯鍵和苷鍵發(fā)生斷裂,易在體內(nèi)發(fā)生水解反應,充分闡明了肉蓯蓉的體內(nèi)代謝產(chǎn)物是主要是苯乙醇苷類降解產(chǎn)物羥基酪醇(HT)、咖啡酸(CA)、高香草酸(HVA)、阿魏酸、3-羥基苯丙酸(3-HPP)等,以磺酸化形式進入血液,經(jīng)尿液排泄。通過各單體化合物以及肉蓯蓉體內(nèi)代謝物組的系統(tǒng)分析,單體和肉蓯蓉血漿中的代謝物體內(nèi)達峰時間不同,單體化合物的體內(nèi)代謝過程并不能代表中藥復雜成分的體內(nèi)真實代謝過程。本論文從單體到總提物的體內(nèi)過程系統(tǒng)研究,提供了豐富的肉蓯蓉代謝物組信息,也為中藥體內(nèi)代謝研究提供新思路。3.基于藥物代謝組學的肉蓯蓉抗血管性癡呆研究建立了雙側頸總動脈(2VO)結扎所致的大鼠血管性癡呆模型,通過Morris水迷宮實驗以及病理切片結果,發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉總苷提取物(CG)給藥后能夠減輕2VO所致的海馬神經(jīng)元的損傷,并顯著改善大鼠的學習記憶能力。建立基于LC-MS技術的藥物代謝組學方法,并研究了肉蓯蓉對血管性癡呆大鼠血漿代謝物組(metabolome)的影響。多元統(tǒng)計分析結果表明給藥組和模型組之間以及模型組與假手術組之間血漿內(nèi)源性代謝物水平存在差異,并初步鑒定了39個血管性癡呆相關差異代謝物。與模型組大鼠相比,CG給藥組顯著調(diào)節(jié)了26個內(nèi)源性代謝物。進一步分析差異代謝物涉及的代謝通路,發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉給藥后的HT、HVA、3-HPP等主要代謝產(chǎn)物,能夠直接參與芳香族氨基酸代謝,如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等代謝通路,從而參與調(diào)節(jié)血管性癡呆的神經(jīng)遞質代謝紊亂。同時,甘油磷脂代謝以及花生四烯酸代謝等通路也受到調(diào)節(jié)。因此,肉蓯蓉可能通過其代謝產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質代謝,改善脂質代謝紊亂、抗氧化損傷、促進抗炎反應等途徑發(fā)揮抗血管性癡呆作用。通過對HT、HVA等潛在藥效物質的活性驗證,發(fā)現(xiàn)其都能夠抑制OGD/R誘導的HUVEC細胞損傷,從而發(fā)揮對腦血管內(nèi)皮細胞保護作用,進一步說明肉蓯蓉中苯乙醇苷類化合物的體內(nèi)代謝產(chǎn)物為肉蓯蓉抗血管性癡呆的主要藥效物質。綜上所述,本論文建立了肉蓯蓉的全成分定性、定量分析方法,闡明了肉蓯蓉的化學成分組,系統(tǒng)研究了肉蓯蓉的體內(nèi)代謝產(chǎn)物,初步闡明了肉蓯蓉抗血管性癡呆的藥效物質為苯乙醇苷類化合物的體內(nèi)降解產(chǎn)物,肉蓯蓉可能通過代謝產(chǎn)物直接參與神經(jīng)遞質代謝、調(diào)節(jié)脂質代謝等多途徑發(fā)揮抗血管性癡呆的藥效。
【圖文】：

蓉防治血管性癡呆的體內(nèi)藥效物質及可能的作用機制，為肉蓯蓉通過“補精益髓”理論逡逑治療神經(jīng)退行性疾病提供依據(jù)。逡逑具體研宄路線如圖５所示。本研究以ＬＣ邋ＭＳ為主要技術手段，建立肉蓯蓉體內(nèi)外逡逑化學成分的定性定量方法，，闡明肉蓯蓉化學物質組以及代謝物組，基于藥物代謝組學方逡逑法和體外活性驗證，系統(tǒng)研究肉蓯蓉防治血管性癡呆的體內(nèi)藥效物質及可能的作用機逡逑制。本研宄的開展同時也為基于代謝組學的中藥藥效物質研究提供有效參考，為中藥體逡逑內(nèi)外成分的全面分析以及藥效物質研究提供思路和方法。逡逑產(chǎn)建立在線加壓提取方法；邐產(chǎn)ＩＴ－ＴＯＦ－ＭＳ分析；逡逑，建立ＲＰＬＣ／ＨＩＬＩＣ方法；邐，Ｑ邋Ｅｘａｃｔｉｖｅ－ＭＳ分析；逡逑產(chǎn)建立ＲＰＬＣ－ＨＩＬＩＣ系統(tǒng)邐，Ｑｔｒａｐ－ＭＳ分析逡逑大鼠血漿、尿液、逡逑１邐１邐糞便、膽汁逡逑定性分析邐定量分析逡逑體內(nèi)代謝逡逑產(chǎn)物鑒定逡逑＂邐裂解規(guī)律總結逡逑構建化學成分組邐構建體內(nèi)代謝物組逡逑２Ｖ0大鼠模型一：ＩＳ片逡逑體外活性驗證邐藥物代謝組學逡逑ｒ多元統(tǒng)計分析；逡逑，Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ邋＜＾１軟件；逡逑

提取溶劑以２．５邋ｍＬ／ｍｉｎ流速進入系統(tǒng)時，產(chǎn)生提取所需的反壓（約１３．０邋ＭＰａ），從而逡逑實現(xiàn)加壓溶劑微提取。將整個提取模塊連接于進樣器后面，并置于柱溫箱中給予一定溫逡逑度（７０°Ｃ），降低水的極性和粘度，提高提取效率。具體裝置及工作原理示意圖見圖６。逡逑２９逡逑
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5;R284


本文編號：2588041