【摘要】：目的:本研究以卵清蛋白(OVA)為過敏原復制哮喘模型,觀察梓醇對哮喘小鼠的影響以及對氣道黏液高分泌的抑制作用,并探討其作用的分子機制。方法:1.分組及模型建立48只SPF級Balb/C小鼠預養(yǎng)一周,隨機分成6組(每組8只):正常對照組(Control)、模型組(Model)、地塞米松組(DEX)、梓醇低劑量組(CL)、梓醇中劑量組(CM)、梓醇高劑量組(CH)。除正常組外其他各組于第1、8、15d腹腔注射OVA和Al(OH)3的混懸致敏液(OVA 0.2mg/m L,Al(OH)3 5 mg/mL)致敏,于第21-27d霧化OVA(2%)生理鹽水激發(fā)液復制哮喘模型。正常對照組以生理鹽水代替致敏液和激發(fā)液。2.給藥方案于實驗第21-27d霧化激發(fā)前1h灌胃。劑量為:DEX組1mg/kg、CL組20mg/kg、CM組40 mg/kg、CH組80 mg/kg,正常對照組和模型對照組以生理鹽水灌胃。3.觀察指標實驗第25-27d,霧化激發(fā)時觀察最初15min內小鼠的引喘潛伏期。第28d,無創(chuàng)小鼠肺功能儀測定氣道反應性(Penh)。第28d Penh實驗完成后處死小鼠,收集血清、左肺肺泡灌洗液(BALF)和右肺中葉。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清中OVA-IgE和肺泡灌洗液(BALF)中IL-13、eotaxin、IL-8、MUC5AC、TSLP、IL-33、MCP-1、IL-1β、AREG(amphiregulin,雙調蛋白)、IL-9和IL-6的含量。HE和PAS染色觀察肺組織病理改變和杯狀細胞增生變化。免疫組化觀察肺組織支氣管MUC5AC、FOXA2、EGFR、NFAT3和P-NFAT3表達情況。流式細胞術分析梓醇對于肺組織中ILC2s的影響。結果:1.引喘潛伏期霧化激發(fā)期間,與正常對照組相比,各實驗組小鼠先出現(xiàn)煩躁不安、摳鼻瘙癢、抓耳撓腮、毛發(fā)凌亂現(xiàn)象,隨后腹肌抽搐,出現(xiàn)持續(xù)的喘息癥狀。隨著霧化激發(fā)時間的延長小鼠體重下降,精神不振。給予梓醇和DEX干預治療后,與哮喘模型組相比上述癥狀得到明顯改善,引喘潛伏期也明顯延長(P0.01)。2.氣道反應性各組小鼠Penh都隨著乙酰甲膽堿濃度的增加而增高。與正常組相比,在乙酰甲膽堿濃度為6.25mg/m L-50mg/m L時,模型組的Penh顯著增高(P0.01);與模型組相比,CH組、CM組和DEX組在乙酰甲膽堿濃度為25mg/mL和50mg/m L時能明顯抑制Penh的增長(P0.01或P0.05);與模型組相比,CL組在乙酰甲膽堿濃度為50mg/m L時能明顯抑制Penh的增長(P0.01)。3.病理學改變梓醇能明顯改善哮喘小鼠肺組織炎性病理變化,并且抑制氣道杯狀細胞的增生。與模型組相比,梓醇各組杯狀細胞陽性面積比例明顯降低(P0.01)。4.黏蛋白MUC5AC ELISA測定結果和免疫組化結果顯示,CH和CM降低BALF中MUC5AC含量,抑制支氣管MUC5AC表達。5.OVA-IgE和炎性細胞因子實驗發(fā)現(xiàn),梓醇顯著降低血清OVA-Ig E水平,對BALF中IL-1β、IL-8、IL-13、IL-25、eotaxin、MUC5AC、MCP-1、TSLP、AREG IL-9和IL-6的水平具有明顯的降低作用。6.MUC5AC信號通路梓醇能提高支氣管MUC5AC生成IL-13信號通路中FOXA2和NFAT3的表達水平,抑制P-NFAT3的表達;抑制EGFR信號通路中EGFR的表達。流式細胞術結果顯示,與哮喘模型組相比,梓醇能夠明顯降低哮喘小鼠肺組織中ILC2s的比例。結論:1.通過小鼠引喘潛伏期、HE染色、PAS染色、Penh等指標,確定本實驗哮喘模型建模成功,梓醇具有明顯的抗哮喘作用。2.梓醇對于氣道黏蛋白MUC5AC分泌具有顯著地抑制作用。3.梓醇對BALF中多種致炎細胞因子具有明顯的抑制作用,并且能夠抑制血清中OVA-IgE的水平。4.梓醇可能通過的IL-13和EGFR兩條信號通路抑制氣道MUC5AC的高表達。
【圖文】：

圖 1 ILC2s 功能圖（Current Opinion in Immunology. 2013,25 (2) :148-155）Fig1 The function of ILC2s活的 ILC2s 可產生大量的炎癥細胞因子，與 Th2 炎癥反應密切相關。ILC2子包括 IL-13、IL-4、IL-5、IL-6、AREG 等，這些細胞因子在嗜酸性粒細單核細胞、B 細胞等炎癥的活化中起到了關鍵作用。另外特別引起我們注意和其活化的 Th2s 細胞均可產生大量的 IL-13，IL-13 可作用于巨噬細胞，活化能增強，在清除外來物的同時產生，還起到抗原提呈的作用；IL-13 還能作 PC 細胞并產生抗體，抗體進一步可以與肥大細胞，嗜堿性粒細胞等結合引放各種炎癥介質；IL-13 可直接作用于哮喘發(fā)作過程中的黏液高分泌和氣道成[25, 26]。另外，ILC2s 產生的 Amphiregulin 為 EGF 家族成員，與杯狀細胞結合可啟動杯狀細胞黏蛋白 MUC5AC 的分泌。2）嗜酸性粒細胞（Eosinophils）來源于骨髓 CD34+祖細胞，其能夠分泌多種

酶 B（protein kinase B，PKB/AKT）的 N 端 PH 結構域結合，使 AK膜上，并在 3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶 1（PDKI）的輔助下，通過酸磷酸化位點（Thr308）和絲氨酸磷酸化位點（Ser473）磷酸化而 途徑激活后，可進一步激活下游的活化 T 細胞核因子 （3Nuclear factorFAT3）繼而上調 MUC5AC 的 mNRA 表達，促使 MUC5AC 分泌增加 介導的信號通路刺激作用下，機體細胞可產生中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）和 EG體結合引起 TACE 酶激活，將 pro-EGFR ligand 斷裂釋放 EGFR lig胞膜上的 EGFR 結合后，引起 EGFR 磷酸化而活化，引起 RAS-G進而進入級聯(lián)反應，順序激活 Raf，MEK1/2，，ERK1/2，SP1,活化的 MUC5AC 的表達[23]。另外，活化的 P-EGFR 可抑制 FOXA2 的表達起黏液的高分泌。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2587847