本文關(guān)鍵詞：尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞凋亡易感性升高的機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 模擬失重 尾部懸吊大鼠模型 心肌細(xì)胞 凋亡易感性 鈣蛋白酶 核轉(zhuǎn)位 異丙腎上腺素

【摘要】：目的：隨著國(guó)際空間站的逐步建成與我國(guó)載人航天活動(dòng)的快速發(fā)展，參加中長(zhǎng)期航天飛行的航天員日益增多，中長(zhǎng)期航天飛行引起了航天員機(jī)體發(fā)生廣泛的適應(yīng)性改變，當(dāng)返回1G重力環(huán)境的地面時(shí)，由于再適應(yīng)失調(diào)，主要表現(xiàn)為立位耐力不良與運(yùn)動(dòng)能力降低。正是因?yàn)楹教靻T站立時(shí)出現(xiàn)立位耐力不良，引起血中兒茶酚胺濃度代償性大幅增加，過(guò)高的代償性兒茶酚胺可能導(dǎo)致心肌的損害，這是在中長(zhǎng)期航天飛行返回地面恢復(fù)初期值得關(guān)注、且需積極防護(hù)的重點(diǎn)工作之一。因此，本研究擬觀測(cè)尾部懸吊4周及其恢復(fù)期大鼠心肌細(xì)胞凋亡率是否改變，同時(shí)探討心肌細(xì)胞凋亡易感性升高的分子機(jī)制。 方法：以尾部懸吊4周大鼠及尾部懸吊4周后恢復(fù)1天的大鼠為研究對(duì)象，采用ELISA法測(cè)量大鼠血漿與左心室組織勻漿中去甲腎上腺素的含量，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。分離與培養(yǎng)成年大鼠原代心肌細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)各種蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位和表達(dá)情況。采用casein zymography法檢測(cè)calpains蛋白酶活性變化。采用siRNA技術(shù)沉默心肌細(xì)胞內(nèi)calpain-1與calpain-2蛋白的表達(dá)，鈣熒光探針Fluo3/AM標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+并用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)Ca2+濃度的變化，用DHE熒光探針檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的變化，免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)calpain-2和CaMKⅡ B之間的相互作用，熒光探針JC-1檢測(cè)線粒體膜電位的變化。結(jié)果： 1尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞凋亡易感性升高 尾部懸吊恢復(fù)期組大鼠血漿與左心室組織勻漿中去甲腎上腺素含量較對(duì)照組與尾部懸吊組顯著增加。尾部懸吊恢復(fù)期組大鼠與β-腎上腺素受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素（ISO）刺激的尾部懸吊組心肌細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組與尾部懸吊組顯著增加，這一現(xiàn)象可被-腎上腺素受體抑制劑心得安（Propranolol）及鈣蛋白酶（calpains）抑制劑PD150606阻斷。 2Calpain-2是尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞凋亡易感性增加的關(guān)鍵調(diào)控分子 尾部懸吊4周組大鼠心肌calpain-1與calpain-2的表達(dá)未見(jiàn)改變，但尾部懸吊組大鼠心肌組織calpain-2活性顯著增加；同時(shí)發(fā)現(xiàn)尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞calpain-2在細(xì)胞核內(nèi)的聚積較對(duì)照組顯著增加，，加入ISO刺激可促進(jìn)尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞calpain-2核轉(zhuǎn)位。尾部懸吊4周組大鼠心肌細(xì)胞核中calpain-2的表達(dá)與活性較對(duì)照組均呈顯著性增加，且加入ISO可促進(jìn)尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞核calpain-2表達(dá)與活性增加。加入calpains抑制劑PD150606處理后，可將升高的心肌細(xì)胞凋亡率水平降至未受ISO刺激的尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率水平，并減少ISO引起的calpain-2核轉(zhuǎn)位；沉默calpain-1與calpain-2基因表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，ISO處理可顯著升高轉(zhuǎn)染了calpain-1siRNA的尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率，相反的，用ISO處理轉(zhuǎn)染了calpain-2siRNA的尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞，其凋亡率并未升高。 3核質(zhì)網(wǎng)與活性氧共同參與調(diào)控尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞calpain-2的激活 無(wú)論ISO刺激與否，L-型鈣離子通道（L-type calcium channels，LTCC）1C、雷喏啶受體2（Ryanodine receptor，RyR2）和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶2（Sarco/endoplasmicreticulum Ca2+-ATPase，SERCA2）在對(duì)照組與尾部懸吊組均沿T管呈橫紋分布，其熒光強(qiáng)度亦無(wú)明顯差別；而用ISO處理后，PLB在對(duì)照組與尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞核膜的聚集程度明顯升高，且尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞核膜PLB的聚集程度又高于對(duì)照組，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ISO誘導(dǎo)的磷酸化Ser16-PLB在尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞核膜的聚集程度也高于對(duì)照組。本研究還發(fā)現(xiàn)ISO刺激后，對(duì)于對(duì)照組與尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞的靜息鈣熒光強(qiáng)度并無(wú)影響，但卻升高了這兩組心肌細(xì)胞胞漿鈣熒光強(qiáng)度峰值，且ISO處理后還可顯著升高尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞的核鈣熒光強(qiáng)度峰值。尾部懸吊恢復(fù)組較對(duì)照組活性氧含量顯著增加，且ISO處理后，超氧陰離子（O2·-）水平在尾部懸吊組與尾部懸吊恢復(fù)組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)均顯著升高。 4Calpain-2經(jīng)線粒體凋亡通路介導(dǎo)尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞凋亡 在尾部懸吊恢復(fù)組和ISO處理的尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)calpain-2的表達(dá)明顯增多且激活的calpain-2增多，同時(shí)核內(nèi)的CaMK Ⅱ B的總量降低，且細(xì)胞核內(nèi)CaMK Ⅱ B隨著細(xì)胞核內(nèi)激活的calpain-2的增多而減少，而calpain-2結(jié)合CaMK Ⅱ B增加；使用calpains抑制劑PD150606可阻斷細(xì)胞核內(nèi)CaMK Ⅱ B蛋白的降解。尾部懸吊恢復(fù)組和ISO處理的尾部懸吊組大鼠心肌細(xì)胞caspase-3（激活型）和caspase-9（激活型）蛋白表達(dá)均顯著升高，心肌細(xì)胞線粒體膜電位(Δψm)均呈現(xiàn)去極化狀態(tài)（綠色熒光），心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)的Cyto C釋放明顯增加，且Cyto C與線粒體共定位顯著減少，Bcl-2/Bax比值明顯降低，而PD150606可阻斷這些現(xiàn)象。 結(jié)論：本研究證實(shí)尾部懸吊4周恢復(fù)1天大鼠心肌細(xì)胞凋亡率增高，其機(jī)制為：恢復(fù)期高濃度兒茶酚胺可使核膜受磷蛋白磷酸化并增加核鈣瞬變峰值。核內(nèi)增加的Ca2+會(huì)進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)位至核內(nèi)的calpain-2，核內(nèi)的calpain-2被激活后降解其底物CaMKⅡ B，從而使Bcl-2的表達(dá)減少，線粒體凋亡通路被激活，導(dǎo)致尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞的凋亡易感性增加，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：模擬失重 尾部懸吊大鼠模型 心肌細(xì)胞 凋亡易感性 鈣蛋白酶 核轉(zhuǎn)位 異丙腎上腺素
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R852.22
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-32
• 第一部分 尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的變化32-44
• 1 材料33
• 2 方法33-37
• 3 結(jié)果37-42
• 4 討論42-44
• 第二部分 尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞凋亡易感性增加的關(guān)鍵性分子靶點(diǎn)44-65
• 1 材料45-46
• 2 方法46-53
• 3 結(jié)果53-63
• 4 討論63-65
• 第三部分 尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞 calpain-2 激活的機(jī)制65-77
• 1 材料65-66
• 2 方法66-67
• 3 結(jié)果67-75
• 4 討論75-77
• 第四部分 激活 calpain-2 介導(dǎo)尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞凋亡的通路77-91
• 1 材料77-78
• 2 方法78-80
• 3 結(jié)果80-89
• 4 討論89-91
• 小結(jié)91-93
• 參考文獻(xiàn)93-100
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果100-102
• 致謝102

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 王云英,張然,余志斌;低壓恒流灌流分離成年大鼠心肌細(xì)胞[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;2005年04期

2 �；�;張琳;余志斌;;培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞存活的形態(tài)標(biāo)志[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;2011年01期

3 岳榮川;胡厚祥;羅濤;李科;張雙;徐磊;劉利;雷蕾;;Calpain活化在H_2O_2誘導(dǎo)的成年小鼠心肌細(xì)胞損傷中的作用[J];西部醫(yī)學(xué);2012年03期

本文編號(hào)：836380