本文關(guān)鍵詞：熱休克蛋白70在高壓氧預(yù)防減壓病中的作用機(jī)制

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【摘要】：當(dāng)機(jī)體所處的環(huán)境氣壓發(fā)生快速大幅度變化時（如潛艇脫險、深水作業(yè)減壓上浮、高空飛行或太空艙外活動），可引起溶解于組織的生理性惰性氣體溢出形成氣泡導(dǎo)致減壓病（decompression sickness, DCS）的發(fā)生。氣泡栓塞部位的不同可導(dǎo)致皮膚瘙癢、出血、關(guān)節(jié)疼痛甚至呼吸困難、癱瘓、死亡等不同表現(xiàn)。脊髓和肺是DCS氣泡的主要靶器官。高壓氧（hyperbaric oxygen, HBO）是治療DCS的重要手段，目前已廣泛應(yīng)用于臨床上一氧化碳中毒、神經(jīng)損傷及糖尿病足等疾病的治療。研究發(fā)現(xiàn)，HBO預(yù)處理可有效預(yù)防脊髓、腦、肝臟等多種組織的缺血缺氧性損傷。我們前期實驗也發(fā)現(xiàn)，18h前單次HBO暴露可通過誘導(dǎo)一氧化氮（nitric oxide, NO）的生成降低大鼠DCS模型的發(fā)病率。然而，NO水平在HBO暴露結(jié)束后短時間內(nèi)即恢復(fù)正常，何種機(jī)制介導(dǎo)了HBO暴露18h后的保護(hù)作用尚須深入研究。高壓氧預(yù)適應(yīng)可引起適度的氧化應(yīng)激，通過動員熱休克蛋白70（heat shock protein70，HSP70）等保護(hù)性蛋白的生成抵御各類損傷，HSP70除了可發(fā)揮分子伴侶功能和參與細(xì)胞耐熱保護(hù)外，還可通過抗凋亡、抗氧化等功能對抗組織細(xì)胞損傷。因此，HSP70很可能作為HBO暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)性蛋白起到預(yù)防DCS的作用。 本課題旨在研究HSP70在HBO預(yù)防DCS損傷中的作用，深入探索HBO預(yù)防DCS的機(jī)制，研究從在體、離體兩方面展開，其中在體研究包括以下三方面： ①研究HBO預(yù)適應(yīng)對大鼠DCS模型氣泡生成的影響。氣泡生成是DCS發(fā)生的主要因素。在高氣壓暴露前18h分別給予大鼠HBO（280kPa-60min，n=10）或常壓空氣（n=10）預(yù)暴露，隨后以“700kPa-90min空氣暴露、3min減壓”方案制備減壓病模型。通過超聲二維影像連續(xù)探測減壓后2h內(nèi)通過大鼠右心系統(tǒng)的氣泡量，發(fā)現(xiàn)HBO并不影響DCS氣泡生成量及生成速率，提示HBO預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用并不是通過減少氣泡生成量實現(xiàn)的。 ②觀察HBO預(yù)適應(yīng)對大鼠肺與脊髓HSP表達(dá)的影響。SD大鼠以280kPa-60min方案純氧暴露后，分別在暴露后即刻、6、12、18、24、30h (n=6)取肺與脊髓，通過Western-blot及免疫組化檢測HSP27、70和90蛋白表達(dá)變化，，發(fā)現(xiàn)HBO暴露18h后HSP70表達(dá)達(dá)到高峰，隨后下降，HSP27和90變化不顯著。HBO暴露前給予HSP70拮抗劑槲皮素及NO合酶抑制劑L-NAME (NG-nitro-L-arginine-methyl ester)均可顯著抑制HSP70的表達(dá)，提示HBO通過NO誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)。 ③探索HSP70在HBO預(yù)防DCS過程中的作用。以“700kPa-90min空氣暴露、3min減壓”制備大鼠DCS模型，暴露前18h給予常壓空氣、HBO（280kPa-60min）、HBO+槲皮素、HBO+L-NAME處理（n=60）�？焖贉p壓后1h檢測肺和脊髓的氧化損傷水平（MDA、8-OHdG、H_2O_2）及凋亡情況（caspase3、9及TUNEL凋亡細(xì)胞染色），發(fā)現(xiàn)DCS模型組氧化損傷及凋亡程度較正常對照明顯升高（P0.05），HBO預(yù)暴露顯著降低了這些損傷（P0.05），槲皮素及L-NAME顯著拮抗了HBO的保護(hù)效應(yīng)（它們各自單獨使用對DCS模型的上述指標(biāo)無影響）。說明HSP70的抗氧化、抗凋亡作用在HBO預(yù)防DCS中發(fā)揮了作用。 上述結(jié)果表明：18h前單次HBO暴露對大鼠DCS有明顯的預(yù)防作用，此效應(yīng)與HSP70的抗氧化和抗凋亡作用有關(guān)。 內(nèi)皮是DCS中最先受到氣泡損傷的組織，離體研究以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為對象，從以下三方面展開： ①觀察HBO預(yù)適應(yīng)對HUVEC表達(dá)HSP的影響。細(xì)胞以280kPa-60min方案98.2%氧氣及1.8%二氧化碳混合氣暴露（即280kPa下暴露氣體中二氧化碳濃度為5%），分別在暴露后即刻、6、12、18、24、30、36、42h (n=6)收集細(xì)胞，通過Western-blot檢測HSP27、32、70和90蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)HBO暴露18h后HSP70表達(dá)達(dá)到高峰，HSP27、32和90升高變化不顯著。L-NAME或槲皮素均可顯著抑制HSP70的表達(dá)，提示NO介導(dǎo)了HBO對HSP70的誘導(dǎo)。 ②HSP70在HBO預(yù)防氧化損傷中的作用。將HUVEC暴露于終濃度為250μmol/L的過氧化氫（hydrogen peroxide，H_2O_2）4h，暴露前18h給予常壓空氣、HBO（280kPa-60min）、HBO+槲皮素、HBO+L-NAME處理（n=6）。H_2O_2處理后檢測細(xì)胞氧化損傷程度（MDA、SOD、GSH-Px）及細(xì)胞活力（LDH、CCK8），結(jié)果表明H_2O_2明顯地?fù)p傷了HUVEC，其氧化損傷指標(biāo)增高，細(xì)胞活性下降（P0.05），HBO預(yù)暴露顯著降低了這些損傷（P0.05），槲皮素及L-NAME顯著拮抗了HBO的保護(hù)效應(yīng)（它們各自單獨使用對上述指標(biāo)無影響）。說明HSP70的抗氧化作用在HBO預(yù)防細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮了作用。 ③闡明HBO誘導(dǎo)HSP70的分子機(jī)制。細(xì)胞以280kPa-60min方案98.2%氧氣及1.8%二氧化碳混合氣暴露后，分別在暴露后即刻、6、12、18h收集細(xì)胞，通過信號蛋白磷酸化芯片檢測Akt、ATF-2、BCR-Abl、CREB、HSP27、ERK、JNK、p38、NF-κB、p53及STAT3通路磷酸化的表達(dá)程度，結(jié)果表明Akt通路在HBO暴露后12h表達(dá)增高，p38通路在暴露后6h增高，當(dāng)使用p38抑制劑SB203580后，HBO對HSP70的誘導(dǎo)被拮抗了。Akt通路可介導(dǎo)HSP70的表達(dá)，說明HBO產(chǎn)生NO后可通過p38及Akt通路誘導(dǎo)HSP70表達(dá)增高。 以上結(jié)果說明HBO預(yù)適應(yīng)可通過p38及Akt通路促進(jìn)HSP70表達(dá)，并通過HSP70的抗損傷作用預(yù)防了內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷。 綜上所述，18h前單次高壓氧預(yù)暴露可通過激活A(yù)kt及p38通路誘導(dǎo)保護(hù)性蛋白HSP70表達(dá)增高，通過其抗氧化抗凋亡的作用減輕氣泡對組織損傷，發(fā)揮DCS預(yù)防效應(yīng)。 本課題明確了HBO預(yù)防DCS中HSP70通路的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探索明確HBO在DCS預(yù)防實踐中的運用提供了新的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：減壓病 高壓氧 熱休克蛋白 內(nèi)皮細(xì)胞 一氧化氮
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R82
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 前言13-16
• 第一部分：高壓氧通過誘導(dǎo)熱休克蛋白 70預(yù)防大鼠減壓病的機(jī)制16-42
• 一、材料與方法16-21
• 二、實驗方法21-30
• 三、實驗結(jié)果30-38
• 四、討論38-42
• 第二部分：高壓氧通過熱休克蛋白 70 預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷42-61
• 一、材料42-45
• 二、實驗方法45-52
• 三、實驗結(jié)果52-57
• 四、討論57-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 綜述：減壓病預(yù)防研究進(jìn)展67-76
• 參考文獻(xiàn)72-76
• 論文發(fā)表情況76-77
• 致謝77

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 鄧璐;孔令曼;宋瑩;;大連地區(qū)潛水減壓病的發(fā)病狀況調(diào)查與分析[J];臨床軍醫(yī)雜志;2010年03期

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本文編號：831180