本文關(guān)鍵詞：模擬微重力對巨核細(xì)胞增殖和分化的影響研究

  更多相關(guān)文章： 模擬微重力 巨核細(xì)胞 c-mpl GATA-1NF-E2RUNX-1Ets-1

【摘要】：研究背景 隨著全世界航空航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展,人類向太空領(lǐng)域的探索和開發(fā)越來越頻繁,空間環(huán)境對生物體及人類機體的影響已成為科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。微重力是空間環(huán)境的主要特點之一,探索微重力對機體的影響以及如何對抗這些影響是航天醫(yī)學(xué)所面臨的重要問題。 地球上的生物都是在1G重力環(huán)境中生長和發(fā)育的,因此重力環(huán)境的改變勢必對其生理系統(tǒng)產(chǎn)生影響。如宇航員在執(zhí)行空間任務(wù)或長期的艙內(nèi)訓(xùn)練后會出現(xiàn)心肺功能紊亂、免疫功能失調(diào)、骨質(zhì)疏松、貧血、鼻出血和關(guān)節(jié)腔出血、感知覺改變等,這些變化的發(fā)生機制的研究對航天員的健康以及人類進(jìn)行長久的空間探索有重要意義。長期以來航天醫(yī)學(xué)家著力于動物、組織及細(xì)胞分子生物學(xué)層面對模擬微重力效應(yīng)的機制進(jìn)行深入研究,并已經(jīng)對成骨細(xì)胞、造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及血小板等數(shù)十種細(xì)胞從形態(tài)、增殖、功能等方面做了相應(yīng)的研究工作,并且對相關(guān)機制有了一些初步的認(rèn)識。 多年來,國內(nèi)外對微重力狀態(tài)下造血系統(tǒng)改變的相關(guān)研究主要集中在“航天性貧血”方面,而目前航天員免疫功能下降及凝血功能改變逐漸得到關(guān)注。循證航天醫(yī)學(xué)研究者對航天飛行中航天員發(fā)生的各種醫(yī)學(xué)問題作了相關(guān)統(tǒng)計,數(shù)據(jù)表明部分航天員在執(zhí)行空間任務(wù)時出現(xiàn)出血或血栓癥狀,并發(fā)現(xiàn)航天員血小板功能發(fā)生改變,因此微重力對凝血系統(tǒng)的影響有待深入探索和研究。目前關(guān)于微重力對凝血功能影響的研究報道較少。最早的相關(guān)報道為1976年一項空間飛行實驗證實空間飛行后小鼠的巨核細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。后于2001年有文獻(xiàn)報道模擬微重力使人體血小板計數(shù)增加但體積減小,2002年Fuse A等報道了模擬微重力使小鼠外周血血小板計數(shù)減少,2009年北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院戴克勝等報道了太空失重環(huán)境下人和嚙齒類動物血小板功能會發(fā)生改變,并地面模擬實驗發(fā)現(xiàn)模擬微重力條件下血小板形態(tài)改變,GP Ⅰ b/Ⅸ/Ⅴ的主要功能亞單位GPⅠba在血小板表面的表達(dá)水平顯著減少,血小板和vWF的結(jié)合能力減弱,粘附及聚集能力下降,動物實驗證明模擬微重力使小鼠尾靜脈出血時間延長。那么,人體血液中血小板壽命僅7-9天,每天至少有十分之一的血小板由巨核細(xì)胞產(chǎn)生更新,并其膜表面糖蛋白和釋放的細(xì)胞因子等均在巨核細(xì)胞階段合成,因此研究微重力對血小板的母體—巨核細(xì)胞的效應(yīng)對探究微重力條件下血小板粘附、聚集功能改變的機制及模擬微重力對凝血系統(tǒng)的影響有重要意義。 巨核細(xì)胞(megakaryocyte, MK)的生成是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,包括造血干細(xì)胞發(fā)育為巨核祖細(xì)胞,再進(jìn)一步分化為成熟的巨核細(xì)胞并釋出血小板。祖細(xì)胞階段的細(xì)胞核內(nèi)的染色體一般是2-3倍體,細(xì)胞具有增殖能力。當(dāng)巨核系祖細(xì)胞進(jìn)一步分化即可通過核分裂而胞質(zhì)不分裂的方式成為成熟的多倍體細(xì)胞并產(chǎn)生血小板,同時,在分化的過程中,特異性表面抗原CD41、CD61、c-mpl等表達(dá)量會逐漸增多。巨核細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)機制類似于紅細(xì)胞系生成的調(diào)節(jié),至少受巨核系集落刺激因子(Meg-CSF)和促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)兩種調(diào)節(jié)因子對各個分化階段進(jìn)行調(diào)節(jié)。其中TPO又名巨核細(xì)胞生長因子,通過與其受體c-mpl特異性結(jié)合可增加巨核細(xì)胞的總數(shù),刺激巨核細(xì)胞合成蛋白質(zhì),增強祖細(xì)胞的DNA合成和增加細(xì)胞多倍體的倍數(shù),最終增加血小板的生成；并且也參與調(diào)節(jié)早期造血和造血干細(xì)胞發(fā)育以及數(shù)量的維持。c-mpl與TPO結(jié)合后引起c-mpl的同源二聚化,進(jìn)而激活酪氨酸激酶(JAK)家族啟動Jak/STAT、PI3K/Akt、Ras/MAPK等信號通路,并激活信號分子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,而c-mpl的表達(dá)減少能關(guān)閉TPO信號,而使巨核細(xì)胞的增殖和分化成熟受阻。 在細(xì)胞增殖和成熟過程中,往往由胞內(nèi)正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子共同作用使之達(dá)到一種穩(wěn)定的生理狀態(tài),GATA-1(GATA binding protein1,核內(nèi)反應(yīng)基因1)、NF-E2(Erythroid Nuclear Factor2,紅細(xì)胞系核因子2)、FOG-1(Friend of GATA-1)、FLI-1(Friend leukemia virus integrationl,白血病病毒綜合因子1)、RUNX-1(Runtrelated transcription factor1, Rant相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1,也叫AML-1)、Ets-1(E26transformation-specific-1, E26轉(zhuǎn)錄因子1)、Meis-1、c-myb、spl等轉(zhuǎn)錄因子即在巨核細(xì)胞增殖和分化成熟的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。其中,NF-E2作用于巨核細(xì)胞分化成熟晚期階段,為巨核細(xì)胞胞質(zhì)成熟、顆粒形成和血小板的發(fā)育所必需,GATA-1、RUNX-1、Ets-1、FLI-1、Meis-1、FOG-1等通常通過協(xié)同作用參與包括c-mpl、PF4、GPⅡb等在內(nèi)的多種靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Ets-1、FLI-1不僅參與巨核細(xì)胞c-mpl、GPⅠbα、GPⅤ、GPⅥ、GPⅨ、vWF、PF4等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,Ets-1還可激活DNA與RUNX-1的結(jié)合,調(diào)控巨核細(xì)胞分化。RUNX-1可通過與不同的轉(zhuǎn)錄因子如GATA-1、Ets-1、CBF-β (Core-binding factor subunit beta)等結(jié)合調(diào)控不同階段巨核細(xì)胞的分化。RUNX-1與轉(zhuǎn)錄激活因子p300組成復(fù)合體可促進(jìn)c-mpl的轉(zhuǎn)錄激活,可與CBF-β、GATA-1、FLI-1、FOG-1組成復(fù)合體啟動c-mpl基因轉(zhuǎn)錄,并相關(guān)研究指出當(dāng)RUNX-1、CBF-β、GATA-1、FLI-1、 FOG-1同時存在組成復(fù)合體時才能啟動c-mpl基因的轉(zhuǎn)錄激活。綜上所述,任何一個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常均可能導(dǎo)致巨核細(xì)胞增殖分化障礙。因此,本實驗即通過檢測巨核細(xì)胞的增殖、特異性抗原表達(dá)、c-mpl表達(dá)及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況研究模擬微重力對巨核細(xì)胞增殖分化的影響及機制。 目前,可以通過空間搭載和地基模型兩種方式獲得微重力而進(jìn)行生物體的微重力效應(yīng)研究,但是空間搭載的實驗機會少,條件苛刻,且耗費巨大,不能滿足對空間環(huán)境的深入探索和研究。小鼠尾吊模型及由美國宇航局(NASA)開發(fā)研制的旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary cell culture system, RCCS)彌補了這個缺陷,RCCS是目前公認(rèn)的地面模擬微重力環(huán)境的培養(yǎng)裝置,它是一種在地面條件下模擬微重力環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)裝置,實驗結(jié)果和真實微重力有很好的相關(guān)性,可以用來做關(guān)于微重力的研究。本實驗使用第四代RCCS (RCCS-4)模擬微重力觀察巨核細(xì)胞的增殖和分化情況并探索其機制。另外,由于巨核細(xì)胞在骨髓中所占的比例甚少,分離純化困難,在體外不能長期培養(yǎng),目前常使用巨核細(xì)胞株作為研究模型,本實驗的研究對象即是具有巨核細(xì)胞生物學(xué)特性且性狀穩(wěn)定的人巨核細(xì)胞白血病來源的CHRF-288-11細(xì)胞系。 研究目的 本實驗旨在研究模擬微重力對巨核細(xì)胞增殖和分化的影響及機制以進(jìn)一步探究微重力環(huán)境對出凝血系統(tǒng)的影響。 研究方法 本實驗應(yīng)用第四代旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)RCCS-4模擬微重力,用人巨核細(xì)胞白血病來源的CHRF-288-11細(xì)胞系作為巨核細(xì)胞模型。實驗分為普通培養(yǎng)組(NG組)和模擬微重力培養(yǎng)組(SMG組),分別培養(yǎng)24h、48h、72h,研究模擬微重力對體外培養(yǎng)巨核細(xì)胞增殖和分化的影響及其機制。首先采用臺盼藍(lán)染色法判斷兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞的活力。進(jìn)而,采用細(xì)胞計數(shù)及CCK8法比較兩種培養(yǎng)條件細(xì)胞的增殖情況；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞表面CD41、CD61表達(dá)以比較兩種培養(yǎng)條件巨核細(xì)胞的分化情況；采用RT-PCR法及Western blot法檢測巨核細(xì)胞血小板生成素受體c-mpl的mRNA及蛋白表達(dá)水平,采用RT-PCR法檢測巨核細(xì)胞增殖分化相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、NF-E2. RUNX-1、Ets-1、Meis-1的mRNA表達(dá)水平,以探索相關(guān)機制。本實驗為獨立重復(fù)實驗,不同時間點之間無相關(guān)性,每組實驗至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,用兩獨立樣本t檢驗法分析比較,P0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。 研究結(jié)果 將細(xì)胞分別在普通培養(yǎng)條件和模擬微重力條件下培養(yǎng),分別培養(yǎng)24h、48h、72h后： (1)SMG組CHRF-288-11細(xì)胞活力與NG組無顯著差異,細(xì)胞活力均保持在80%以上。 (2)SMG組細(xì)胞計數(shù)及CCK8法測得的450nm處吸光度(optical delnsity, OD值)均顯著低于NG組。 (3)SMG組G2/M期細(xì)胞比例顯著低于NG組。 (4)培養(yǎng)24h時SMG組與NG組CD41+CD61+細(xì)胞比例無顯著差異,培養(yǎng)48h、72h后SMG組CD41+CD61+細(xì)胞比例顯著低于NG組。 (5)SMG組細(xì)胞c-mpl mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著低于NG組。 (6)使用50ng/ml TPO刺激CHRF-288-11細(xì)胞72h,可使普通培養(yǎng)組細(xì)胞c-mpl mRNA表達(dá)量上調(diào)而未能使SMG組細(xì)胞c-mpl mRNA表達(dá)上調(diào)。 (7)與NG組比較,在培養(yǎng)24h、48h、72h時SMG組GATA-1mRNA表達(dá)量均上調(diào)；培養(yǎng)72h時SMG組NF-E2mRNA表達(dá)量上調(diào)；培養(yǎng)48h、72h時SMG組RUNX-1、Ets-1mRNA表達(dá)量下調(diào)。 結(jié)論 模擬微重力可以抑制體外培養(yǎng)巨核細(xì)胞的增殖和分化,其機制可能是由于巨核細(xì)胞存在重力敏感分子,在微重力條件下重力敏感分子表達(dá)改變而導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化發(fā)生變化。其中轉(zhuǎn)錄因子RUNX-1、Ets-1下調(diào)導(dǎo)致c-mpl基因轉(zhuǎn)錄激活障礙,c-mpl表達(dá)水平下調(diào),部分關(guān)閉了c-mpl介導(dǎo)的信號通路可能是模擬微重力環(huán)境巨核細(xì)胞增殖和分化被抑制的相關(guān)機制。
【關(guān)鍵詞】：模擬微重力 巨核細(xì)胞 c-mpl GATA-1NF-E2RUNX-1Ets-1
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R85
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-23
• 1. 微重力與模擬微重力17-18
• 2. 模擬微重力對細(xì)胞影響的研究現(xiàn)狀18-21
• 3. 巨核細(xì)胞增殖分化特征及生成調(diào)控21-22
• 4. 研究目的和意義22-23
• 第一章 模擬微重力對巨核細(xì)胞增殖和分化的影響23-33
• 1.1 實驗材料23-24
• 1.2 實驗方法24-27
• 1.3 實驗結(jié)果27-31
• 1.4 討論31-33
• 第二章 模擬微重力抑制巨核細(xì)胞增殖和分化的機制研究33-57
• 第一部分 模擬微重力對巨核細(xì)胞c-mpl表達(dá)的影響33-46
• 2.1 實驗材料34-36
• 2.2 實驗方法36-42
• 2.3 實驗結(jié)果42-45
• 2.4 討論45-46
• 第二部分 模擬微重力對巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)的影響46-57
• 3.1 實驗材料47-48
• 3.2 實驗方法48-51
• 3.3 實驗結(jié)果51-55
• 3.4 討論55-57
• 全文總結(jié)57-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 攻讀學(xué)位期間成果64-65
• 致謝65-67

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 李英賢;李琦;王曉剛;李瑩輝;;微重力細(xì)胞分子生物學(xué)效應(yīng)研究進(jìn)展[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;2011年06期

2 袁明,姜世忠;中國航天醫(yī)學(xué)進(jìn)展[J];空間科學(xué)學(xué)報;2005年04期

3 印宗毅;陳東英;;模擬微重力對生物體機能影響的研究新進(jìn)展[J];航空航天醫(yī)學(xué)雜志;2013年01期

4 胡江,胡平,李濤,蔣凌飛,陳娟,陶祖萊;成纖維細(xì)胞在聚羥基丁酸酯表面黏附與種植研究[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2001年04期

5 龍星星;鐘田雨;平寶紅;鄭磊;高雅;周淑蕓;;模擬微重力對K562細(xì)胞增殖的影響[J];微循環(huán)學(xué)雜志;2011年01期

6 趙詠梅;劉林;;血小板生成素與受體c-Mpl分子結(jié)構(gòu)及信號通路的研究進(jìn)展[J];西部醫(yī)學(xué);2008年01期

7 楊默,李桂霞;調(diào)控巨核系造血的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子(英文)[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2002年06期

8 莫姝;楊默;于潔;李志光;;血小板生成素(TP0)及其受體(C-Mpl)的新作用[J];中國小兒血液與腫瘤雜志;2006年02期

9 萬玉民;李瑩輝;白延強;宋偉;季啟明;;國外航天醫(yī)學(xué)研究的回顧與啟示[J];載人航天;2011年05期

，

本文編號：755939