本文關(guān)鍵詞：芥子氣原型的體內(nèi)分析新方法及“脂庫(kù)蓄積”與內(nèi)源性生物標(biāo)志物差異的發(fā)現(xiàn)

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【摘要】：芥子氣(Sulfur Mustard,美軍代號(hào)HD)是難防難治化學(xué)戰(zhàn)劑的代表及外軍重點(diǎn)研究的目標(biāo)化學(xué)戰(zhàn)劑,是世界現(xiàn)存化學(xué)武器的主要填充劑,也是日軍在華遺棄化學(xué)武器的主要成份。其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,容易合成,恐怖威脅巨大。因此,基于應(yīng)對(duì)化學(xué)戰(zhàn)、化學(xué)恐怖襲擊的迫切前提,以及我國(guó)所面臨的復(fù)雜周邊戰(zhàn)事環(huán)境,在目前尚無(wú)有效的預(yù)防和治療措施條件下,迫切需要通過(guò)新的研究手段來(lái)深入闡述芥子氣中毒機(jī)制。芥子氣作為廣泛的烷基化試劑而引起多靶點(diǎn)多臟器中毒損傷作用,但傳統(tǒng)毒理學(xué)研究大多數(shù)局限于關(guān)注孤立的某些通路或某一個(gè)基因、蛋白的變化,因此,迄今為止其具體的毒理作用機(jī)制并未完全闡明。本課題首先基于系統(tǒng)毒理學(xué)研究思路,冀希在整體層面上探索芥子氣的復(fù)雜毒理作用。側(cè)重于應(yīng)用整合代謝組學(xué)技術(shù),從不同生物樣本層面研究體內(nèi)處置過(guò)程中代謝物組的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì),尋找發(fā)現(xiàn)芥子氣中毒相關(guān)的內(nèi)源性生物標(biāo)志物,探討各種機(jī)制間的相互聯(lián)系和作用,以及不同機(jī)制間發(fā)揮作用的先后順序與重要程度,提出輔助臨床診斷指標(biāo)和醫(yī)學(xué)干預(yù)措施,以期對(duì)于芥子氣的干預(yù)和治療產(chǎn)生一定的指導(dǎo)作用。芥子氣在體內(nèi)具有反應(yīng)活性高、代謝速度快等特點(diǎn),對(duì)分析方法的穩(wěn)定性和靈敏度要求非常高,但經(jīng)典分析方法在分析生物樣本中芥子氣原型時(shí)存在瓶頸,如氣相色譜法分析芥子氣存在熱不穩(wěn)定,同位素示蹤法無(wú)法區(qū)分原型與代謝產(chǎn)物,基于膠體金的原子吸收法存在內(nèi)源性巰基化合物干擾等問(wèn)題,導(dǎo)致目前芥子氣體內(nèi)處置數(shù)據(jù)的不確定性。本課題在建立高靈敏度和高穩(wěn)定性的芥子氣原型體內(nèi)分析新方法基礎(chǔ)上,將分析毒理學(xué)研究思路應(yīng)用于芥子氣原型在體內(nèi)吸收、分布等處置過(guò)程的分析,深入且清晰地闡明芥子氣原型在體內(nèi)的代謝模式、途徑與機(jī)制等問(wèn)題。進(jìn)而準(zhǔn)確把握芥子氣在體內(nèi)的留存方式和時(shí)相,對(duì)于發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵毒理作用的靶細(xì)胞及靶器官,指導(dǎo)臨床干預(yù)治療的位點(diǎn)以及有效時(shí)間窗等具有非常重要的意義。具體研究結(jié)果如下:(1)損傷內(nèi)源性生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)尿液樣本分析結(jié)合反相液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(RPLC-MS)與親水作用色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HILIC-MS)技術(shù),綜合運(yùn)用多種譜圖解析手段共鑒定與芥子氣相關(guān)的內(nèi)源性生物標(biāo)志物34個(gè),主要有核酸類代謝產(chǎn)物,如胞嘧啶、脫氧胞苷、脫氧腺苷等;色氨酸及其代謝產(chǎn)物,如黃尿酸、犬尿喹啉酸、葡糖醛酸化吲哚乙酸等;苯丙氨酸及其代謝產(chǎn)物,如阿魏酸、馬尿酸等;能量代謝相關(guān)代謝產(chǎn)物,如檸檬酸、葡糖酸、膽汁酸鹽等;以及一些與食物消化相關(guān)的黃酮類化合物,如大豆素與葡糖醛酸化大豆素等。涉及到的體內(nèi)代謝途徑主要包括DNA的損傷修復(fù)代謝,炎癥相關(guān)氨基酸代謝,腸道菌群失衡,糖、脂肪等能量物質(zhì)代謝,以及II相酶誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化途徑(如葡萄糖醛酸化和硫酸酯化)等。血漿樣本分析綜合運(yùn)用多種譜圖解析技術(shù)共鑒定與芥子氣相關(guān)的極性小分子內(nèi)源性生物標(biāo)志物27個(gè),主要有膽汁酸類代謝產(chǎn)物,如膽酸、脫氧膽酸、甘氨酸膽酸等;氨基酸及其代謝產(chǎn)物,如苯丙氨酸、色氨酸、苯乙醇硫酸鹽等;能量代謝相關(guān)代謝產(chǎn)物,如檸檬酸、尿酸等;以及磷脂類化合物,如溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿等。同時(shí),應(yīng)用脂質(zhì)吸附填料特征提取血漿中脂類成分,通過(guò)全信息串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)(MSE),鑒定出163種脂類代謝產(chǎn)物,并針對(duì)這些脂類化合物進(jìn)行了靶向脂質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)與芥子氣代謝相關(guān)的甘油三酯亞型、甘油二酯以及磷脂類內(nèi)源性生物標(biāo)志物。結(jié)合血液生化指標(biāo)結(jié)果和芥子氣皮膚染毒大鼠血漿中代謝組(包括小分子極性代謝產(chǎn)物與脂類代謝產(chǎn)物)隨時(shí)間變化的軌跡,闡述了芥子氣與肝臟急性損傷的相關(guān)性和物質(zhì)基礎(chǔ),以及與不飽和脂類代謝產(chǎn)物高度相關(guān)的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。組織樣本分析通過(guò)對(duì)不同臟器(包括肝、肺、脾、腦和胰腺)在中毒后的代謝輪廓軌跡的分析,探討了芥子氣作用于不同器官時(shí)所造成的代謝狀態(tài)改變的方向和效應(yīng)。結(jié)合肝臟組織極性代謝產(chǎn)物的代謝組學(xué)軌跡分析與非極性脂類代謝產(chǎn)物的非靶標(biāo)脂質(zhì)組學(xué)分析,以及血液生化分析中指征肝功能損傷的轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)變化趨勢(shì)等,發(fā)現(xiàn)芥子氣在6-12 h的潛伏期內(nèi)就已造成肝臟功能的急性損傷,具體表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶的升高,膽汁酸的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)受阻,肝臟代謝酶體系的抑制,溶血性磷脂含量的升高等。肝臟組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了膽汁酸代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)關(guān)鍵酶基因的RNA表達(dá)水平下調(diào)。(2)芥子氣原型體內(nèi)分析新方法及“脂庫(kù)蓄積”利用芥子氣的烷基化反應(yīng)活性,通過(guò)衍生化試劑硫代乙酸鉀(PTA)與其發(fā)生親核反應(yīng),生成穩(wěn)定且兼具良好色譜和質(zhì)譜行為的衍生化產(chǎn)物雙乙酰硫基乙硫醚(BTAETE),進(jìn)而采用同位素稀釋法液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)衍生化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品中芥子氣的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法(LC-MS/MS)進(jìn)行定性和定量分析。該LC-MS/MS分析方法的運(yùn)行時(shí)間短、回收率高、精密度和重復(fù)性良好,尤其是靈敏度和穩(wěn)定性高于現(xiàn)行經(jīng)典檢測(cè)技術(shù)(乙腈溶液中的最低定量限達(dá)到0.1 ng/m L,而全血中的最低定量限達(dá)到0.5 ng/m L),且衍生化方法簡(jiǎn)便快捷,樣品制備與檢測(cè)分析可在1小時(shí)內(nèi)完成,能有效分離檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)樣品中芥子氣原型,成功應(yīng)用于揭示生物樣品中芥子氣原型存在的定量分析。通過(guò)對(duì)芥子氣皮膚染毒大鼠體內(nèi)血液及不同組織中芥子氣原型分子的代謝行為研究,結(jié)果顯示芥子氣透皮后迅速進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并隨血液分布到全身臟器,其脂肪組織中的含量要遠(yuǎn)高于非脂肪臟器(至少15倍),經(jīng)計(jì)算脂肪組織中僅在芥子氣達(dá)峰時(shí)蓄積量就占實(shí)際染毒劑量的1.25%,出現(xiàn)了明顯的“脂庫(kù)蓄積”現(xiàn)象,且在較高濃度下能夠維持一定時(shí)間(消除半衰期為1.3-2 h),與現(xiàn)有體內(nèi)代謝數(shù)據(jù)相比,觀測(cè)分布與消除時(shí)相均有所延長(zhǎng);進(jìn)一步通過(guò)毒代動(dòng)力學(xué)分析表明芥子氣原型在脂肪組織中1-3h達(dá)到平均峰值,達(dá)峰后迅速消除,脂肪內(nèi)平均駐留時(shí)間為2.5-5.3 h,同時(shí)其含量存在一定的染毒劑量相關(guān)性。目前還沒(méi)有見到針對(duì)脂肪組織中芥子氣的毒代動(dòng)力學(xué)相關(guān)研究報(bào)道,本論文應(yīng)用建立的芥子氣原型體內(nèi)分析新方法首次發(fā)現(xiàn)并證明了“脂庫(kù)蓄積”,并且全面分析了芥子氣在生物體內(nèi)的代謝分布處置全過(guò)程。綜上分析,芥子氣中毒存在非常明顯的時(shí)程效應(yīng)和復(fù)合效應(yīng),在潛伏期主要以DNA的損傷修復(fù)、脂質(zhì)過(guò)氧化與肝臟急性損傷等為主;發(fā)展期主要表現(xiàn)為過(guò)度炎癥反應(yīng);恢復(fù)期則表現(xiàn)為能量反饋代謝。針對(duì)芥子氣中毒不同時(shí)期的多靶點(diǎn)毒性效應(yīng),臨床診斷指標(biāo)和醫(yī)學(xué)干預(yù)措施應(yīng)采取分期分型的靶向治療手段。鑒于“脂庫(kù)蓄積”的時(shí)程分析結(jié)論,在早期可結(jié)合轉(zhuǎn)氨酶等臨床生化指標(biāo)與DNA損傷標(biāo)志物等來(lái)輔助芥子氣中毒的臨床診斷,并針對(duì)肝臟損傷和清除自由基等方面進(jìn)行相關(guān)醫(yī)學(xué)干預(yù),而在中期則要以抗炎治療為主,后期需要側(cè)重于能量代謝功能的修復(fù)。同時(shí),在中毒早期(3h內(nèi))可針對(duì)脂肪組織采用脂靶向清除劑,及時(shí)干預(yù)或阻斷芥子氣的繼發(fā)性損傷進(jìn)程。
【關(guān)鍵詞】：衍生化 同位素稀釋法 定量分析 毒代動(dòng)力學(xué) 脂庫(kù)蓄積 代謝組學(xué) 脂質(zhì)組學(xué) 高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用 芥子氣 皮膚染毒 尿液 血漿 組織 主成分分析 偏最小二乘法-判別分析 正交信號(hào)校正偏最小二乘法-判別分析
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R82;O657.63
【目錄】：

• 縮略詞表9-11
• 摘要11-14
• ABSTRACT14-18
• 第一章 前言18-40
• 1.1 芥子氣中毒機(jī)制、體內(nèi)代謝過(guò)程與原型分析方法概述19-23
• 1.1.1 芥子氣中毒機(jī)制研究19-20
• 1.1.2 芥子氣體內(nèi)分布、代謝與蓄積20-22
• 1.1.3 芥子氣原型體內(nèi)分析方法22-23
• 1.2 基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)研究方法策略23-28
• 1.2.1 代謝組學(xué)概述24-25
• 1.2.2 基于LC-MS的代謝組學(xué)研究技術(shù)25-27
• 1.2.3 脂質(zhì)組學(xué)——代謝組學(xué)研究的重要分支27
• 1.2.4 代謝組學(xué)及脂質(zhì)組學(xué)在系統(tǒng)毒理學(xué)中的應(yīng)用前景27-28
• 1.3 課題立項(xiàng)背景與意義28-30
• 1.3.1 立項(xiàng)背景28-29
• 1.3.2 研究的必要性29-30
• 1.4 主要工作30-32
• 1.4.1 研究?jī)?nèi)容30-31
• 1.4.2 研究目標(biāo)31
• 1.4.3 研究的關(guān)鍵問(wèn)題31-32
• 參考文獻(xiàn)32-40
• 第二章 尿液樣本的代謝組學(xué)分析40-72
• 2.1 引言40-41
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料41-43
• 2.2.1 試劑41-42
• 2.2.2 儀器42
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)防護(hù)42-43
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 2.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)43
• 2.3.2 尿液處理43-44
• 2.3.3 LC-MS數(shù)據(jù)采集44-45
• 2.3.4 數(shù)據(jù)處理和分析45-46
• 2.4 結(jié)果與討論46-68
• 2.4.1 空白對(duì)照組樣本分析（數(shù)據(jù)可靠性分析）46-48
• 2.4.2 代謝軌跡分析48-52
• 2.4.3 內(nèi)源性生物標(biāo)志物的篩選和鑒定52-66
• 2.4.4 代謝輪廓的量效分析66-68
• 2.5 結(jié)論68
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 第三章 血漿樣本的代謝組學(xué)分析72-90
• 3.1 引言72
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料72-73
• 3.2.1 試劑72-73
• 3.2.2 儀器73
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物73
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法73-76
• 3.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)73-74
• 3.3.2 血漿生化指標(biāo)測(cè)定與分析74
• 3.3.3 血漿樣品處理74-75
• 3.3.4 LC-MS數(shù)據(jù)采集75-76
• 3.3.5 數(shù)據(jù)處理和分析76
• 3.4 結(jié)果與討論76-87
• 3.4.1 血液生化指標(biāo)分析76-78
• 3.4.2 代謝軌跡分析78-83
• 3.4.3 內(nèi)源性生物標(biāo)志物分析83-86
• 3.4.4 不同染毒途徑代謝輪廓差異分析86-87
• 3.5 結(jié)論87
• 參考文獻(xiàn)87-90
• 第四章 組織樣本的代謝組學(xué)分析90-102
• 4.1 引言90
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料90-91
• 4.2.1 試劑90-91
• 4.2.2 儀器91
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物91
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法91-94
• 4.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)91-92
• 4.3.2 組織樣品處理92
• 4.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)92-94
• 4.3.4 LC-MS數(shù)據(jù)采集94
• 4.3.5 數(shù)據(jù)處理和分析94
• 4.4 結(jié)果與討論94-99
• 4.4.1. 肝臟組織代謝輪廓分析95-98
• 4.4.2 脾臟組織代謝輪廓分析98
• 4.4.3 肺組織代謝輪廓分析98
• 4.4.4 胰腺組織代謝輪廓分析98
• 4.4.5 肝臟組織膽汁酸鹽代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑基因表達(dá)水平改變98-99
• 4.5 結(jié)論99-100
• 參考文獻(xiàn)100-102
• 第五章 血漿樣本的脂質(zhì)組學(xué)分析102-120
• 5.1 引言102
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料102-103
• 5.2.1 試劑102-103
• 5.2.2 儀器103
• 5.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物103
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法103-105
• 5.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)103-104
• 5.3.2 血漿樣品處理104
• 5.3.3 LC-MS數(shù)據(jù)采集104-105
• 5.3.4 數(shù)據(jù)處理和分析105
• 5.4 結(jié)果與討論105-117
• 5.4.1 數(shù)據(jù)可靠性分析105-107
• 5.4.2 脂類代謝產(chǎn)物的定性分析107-112
• 5.4.3 脂類代謝組學(xué)分析112-117
• 5.5 結(jié)論117-118
• 參考文獻(xiàn)118-120
• 第六章 組織樣本的脂質(zhì)組學(xué)分析120-126
• 6.1 引言120
• 6.2 實(shí)驗(yàn)材料120-121
• 6.2.1 試劑120
• 6.2.2 儀器120-121
• 6.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物121
• 6.3 實(shí)驗(yàn)方法121-122
• 6.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)121
• 6.3.2 組織樣品處理121-122
• 6.3.3 LC-MS數(shù)據(jù)采集122
• 6.3.4 數(shù)據(jù)處理和分析122
• 6.4 結(jié)果與討論122-124
• 6.4.1. 肝臟組織脂類代謝輪廓分析124
• 6.4.2 腦、脾臟和肺組織脂類代謝輪廓分析124
• 6.4.3 胰腺組織脂類代謝輪廓分析124
• 6.5 結(jié)論124-125
• 參考文獻(xiàn)125-126
• 第七章 芥子氣原型分析方法的建立126-138
• 7.1 引言126-127
• 7.2 實(shí)驗(yàn)材料127-128
• 7.2.1 試劑127
• 7.2.2 儀器127-128
• 7.3 實(shí)驗(yàn)方法128-131
• 7.3.1 溶液配制與衍生化產(chǎn)物的制備128
• 7.3.2 衍生化反應(yīng)條件的考察128-129
• 7.3.3 LC-MS/MS條件優(yōu)化129-130
• 7.3.4 方法學(xué)考察130-131
• 7.4 結(jié)果與討論131-136
• 7.4.1 衍生化產(chǎn)物的表征131
• 7.4.2 衍生化條件優(yōu)化和衍生化效率131-133
• 7.4.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果133-136
• 7.5 結(jié)論136
• 參考文獻(xiàn)136-138
• 第八章 大鼠皮膚芥子氣染毒后原型檢測(cè)及“脂庫(kù)蓄積”138-160
• 8.1 引言138-139
• 8.2 實(shí)驗(yàn)材料139-140
• 8.2.1 試劑139
• 8.2.2 儀器139
• 8.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物139-140
• 8.3 實(shí)驗(yàn)方法140-144
• 8.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與溶液配制140-141
• 8.3.2 生物樣本處理?xiàng)l件優(yōu)化141
• 8.3.3 體外染毒實(shí)驗(yàn)141-143
• 8.3.4 方法學(xué)考察143
• 8.3.5 染毒大鼠體內(nèi)芥子氣原型的檢測(cè)143-144
• 8.4 結(jié)果與討論144-156
• 8.4.1 脂肪系數(shù)檢測(cè)結(jié)果144
• 8.4.2 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果144-148
• 8.4.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果148-151
• 8.4.4 染毒大鼠全血中芥子氣原型的代謝動(dòng)力學(xué)研究151-153
• 8.4.5 大鼠皮膚染毒體內(nèi)芥子氣原型的代謝行為及“脂庫(kù)蓄積”153-156
• 8.5 結(jié)論156-157
• 參考文獻(xiàn)157-160
• 第九章 研究總結(jié)與展望160-166
• 9.1 研究工作總結(jié)與討論160-163
• 9.1.1 不同生物樣本的代謝組學(xué)分析160-161
• 9.1.2 芥子氣中毒機(jī)制相關(guān)性分析161-162
• 9.1.3 芥子氣原型分子檢測(cè)方法建立及應(yīng)用162-163
• 9.2 論文創(chuàng)新點(diǎn)163-164
• 9.3 展望164-166
• 文獻(xiàn)綜述166-180
• 參考文獻(xiàn)174-180
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文180-181
• 附錄 1181-185
• 附錄 2185-187
• 致謝18

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中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 華凌;“外瘦內(nèi)胖” 易患2型糖尿病[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2013年

2 記者 張歡;鄭商所批準(zhǔn)三家菜籽油交割倉(cāng)庫(kù)[N];期貨日?qǐng)?bào);2009年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 徐斌;芥子氣原型的體內(nèi)分析新方法及“脂庫(kù)蓄積”與內(nèi)源性生物標(biāo)志物差異的發(fā)現(xiàn)[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

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本文編號(hào)：585708