本文關(guān)鍵詞：黑木耳肽鈣螯合物對(duì)模擬微重力誘導(dǎo)骨流失防護(hù)作用研究

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【摘要】：近些年來,我國載人航天事業(yè)飛速發(fā)展,隨之而來的失重性骨流失問題已不容忽視。航天飛行中機(jī)體會(huì)出現(xiàn)骨鈣流失,骨密度減小,骨骼機(jī)械強(qiáng)度下降等現(xiàn)象,在返回地面后短時(shí)間內(nèi)仍無法完全恢復(fù);這不僅會(huì)危及航天員的生命健康,而且可能會(huì)影響到航天任務(wù)的執(zhí)行與開展情況。本研究首次以黑木耳蛋白為載體,深入研究其水解肽與鈣離子形成的金屬離子螯合物對(duì)模擬微重力誘導(dǎo)骨流失的防護(hù)作用。該肽鈣螯合物既可以通過機(jī)體對(duì)肽的特殊吸收機(jī)制加速其在微重力環(huán)境下中對(duì)鈣離子的吸收和利用,提高其生物學(xué)效價(jià);同時(shí)也為黑木耳蛋白等天然產(chǎn)物提取物的應(yīng)用提供了一個(gè)新的思路和方向。本課題主要研究內(nèi)容如下:黑木耳蛋白提取條件的優(yōu)化:首次研究壓力對(duì)黑木耳蛋白提取效果的影響,通過比較高壓、減壓與常壓條件下黑木耳蛋白得率的高低,確定高壓均質(zhì)法為黑木耳蛋白的最優(yōu)提取方法,最佳提取條件為料液比1:104g/mL,均質(zhì)壓力25 MPa,均質(zhì)時(shí)間25 min,蛋白得率可達(dá)5.35%。蛋白水解方法及條件的篩選:對(duì)所得黑木耳蛋白分別進(jìn)行不同時(shí)間的酶解和堿解,通過研究不同水解肽及其肽鈣螯合物對(duì)體外成骨細(xì)胞(OB)促增殖活性作用的差異篩選出最優(yōu)肽段,并確定胰蛋白酶酶解為水解方法,酶解條件為pH 8.0,37℃條件下酶解30 min;該條件下所得肽鈣螯合物促OB增殖率可高達(dá)90%。黑木耳多肽的純化:采用半制備型高效液相設(shè)備對(duì)最優(yōu)肽段的功能組分進(jìn)行分離純化,通過比較不同出峰時(shí)間所得組分及對(duì)應(yīng)的肽鈣螯合物促OB增殖活性的差異確定主要功能組分為AP-2。并對(duì)AP-2的蛋白分子量及其氨基酸組成進(jìn)行分析與測(cè)定。研究結(jié)果表明主要功能組分AP-2為分子量為10573 Da多肽,該多肽含所有人體必需氨基酸,富含纈氨酸和蛋氨酸,是一類優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源。肽鈣螯合條件的優(yōu)化:分別以肽鈣螯合比,螯合pH,螯合時(shí)間和螯合溫度為單因素,以促OB增殖率作為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面優(yōu)化法確定功能組分AP-2與鈣離子螯合物的最佳工藝條件為肽鈣比2.4:1,pH 9.0,螯合時(shí)間63 min及螯合溫度68℃,該條件下促OB增殖率可達(dá)98.2%。模擬微重力誘導(dǎo)骨流失體外防護(hù)作用研究:采用二維雙相多樣本回轉(zhuǎn)器(2D-RWVS)系統(tǒng)建立骨流失模型,研究結(jié)果表明功能組分AP-2與鈣離子所形成的螯合物可有效增加模擬微重力下OB中鈣含量,并能夠提高其堿性磷酸酶(ALP)活力,對(duì)模擬微重力誘發(fā)的骨流失具有一定程度的防護(hù)作用。模擬微重力誘導(dǎo)骨流失體內(nèi)防護(hù)作用研究:以昆明小鼠為試驗(yàn)對(duì)象,采用尾吊法建立空間微重力模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黑木耳肽鈣螯合物不僅可以有效恢復(fù)模擬微重力引起的免疫臟器損傷,并能夠減少小鼠負(fù)重骨中骨密度的下降,增加骨中無機(jī)礦物鹽含量;而且能夠顯著抑制血清中抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)活力,提高ALP活力,對(duì)模擬微重力誘導(dǎo)的骨流失具有一定程度的防護(hù)作用。本課題為開展空間微重力誘導(dǎo)骨流失防護(hù)途徑的研究提供了理論基礎(chǔ),并對(duì)進(jìn)一步開發(fā)新型骨流失防護(hù)劑提供了一定的價(jià)值;同時(shí),對(duì)地面骨質(zhì)疏松的研究具有一定的參考意義。
【關(guān)鍵詞】：黑木耳 肽鈣螯合物 模擬微重力 骨流失防護(hù)
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R85
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第1章 緒論12-30
• 1.1 課題來源及研究背景和意義12-13
• 1.2 空間微重力環(huán)境及其誘導(dǎo)骨流失的研究進(jìn)展13-20
• 1.2.1 空間微重力環(huán)境及其影響13-14
• 1.2.2 空間微重力誘導(dǎo)失重性骨流失14-20
• 1.3 空間微重力誘導(dǎo)骨流失的防護(hù)現(xiàn)狀20-23
• 1.3.1 生理防護(hù)措施21-22
• 1.3.2 藥物防護(hù)措施22
• 1.3.3 營養(yǎng)防護(hù)措施22-23
• 1.4 植物蛋白研究現(xiàn)狀23-24
• 1.4.1 植物蛋白的功能活性研究現(xiàn)狀23-24
• 1.4.2 黑木耳蛋白的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀24
• 1.5 金屬離子螯合物的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀24-26
• 1.5.1 金屬離子螯合物功能活性研究現(xiàn)狀25
• 1.5.2 肽鈣螯合物的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀25-26
• 1.6 實(shí)驗(yàn)課題研究內(nèi)容26-30
• 1.6.1 實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容26-28
• 1.6.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線28-30
• 第2章 材料與方法30-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料30-32
• 2.1.1 材料與試劑30-31
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備31-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)原料制備32-37
• 2.2.1 黑木耳蛋白提取方法優(yōu)化32-35
• 2.2.2 黑木耳蛋白水解條件優(yōu)化35-37
• 2.3 黑木耳最佳肽段的篩選37-40
• 2.3.1 成骨細(xì)胞的提取37-38
• 2.3.2 成骨細(xì)胞的鑒定38-39
• 2.3.3 成骨細(xì)胞增殖活性研究39
• 2.3.4 黑木耳肽段的篩選39-40
• 2.4 黑木耳肽段的純化及其氨基酸分析40-41
• 2.4.1 黑木耳多肽功能性成分純化40
• 2.4.2 純化組分分子量測(cè)定40-41
• 2.4.3 純化組分氨基酸組成分析41
• 2.5 黑木耳多肽與鈣離子螯合工藝優(yōu)化41-43
• 2.5.1 肽鈣螯合工藝的單因素實(shí)驗(yàn)41-42
• 2.5.2 肽鈣螯合工藝的響應(yīng)面優(yōu)化42
• 2.5.3 肽鈣螯合物的紅外表征42-43
• 2.6 肽鈣螯合物對(duì)模擬微重力誘導(dǎo)骨流失的體外防護(hù)作用研究43-44
• 2.6.1 模擬微重力細(xì)胞模型建立43
• 2.6.2 測(cè)定指標(biāo)與方法43-44
• 2.7 肽鈣螯合物對(duì)模擬微重力誘導(dǎo)骨流失的體內(nèi)防護(hù)作用研究44-47
• 2.7.1 模擬微重力小鼠尾吊模型建立44-45
• 2.7.2 測(cè)定指標(biāo)與方法45-47
• 2.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理..47-48
• 第3章 黑木耳多肽的制備48-71
• 3.1 黑木耳蛋白提取方法優(yōu)化48-57
• 3.1.1 高壓均質(zhì)法對(duì)黑木耳蛋白得率的影響48-54
• 3.1.2 減壓提取法對(duì)黑木耳蛋白得率的影響54-56
• 3.1.3 飽和硫酸銨溶液法鹽析黑木耳蛋白56-57
• 3.2 黑木耳蛋白水解條件確定57-62
• 3.2.1 酶解法對(duì)黑木耳蛋白水解效果的影響..57-60
• 3.2.2 堿解法對(duì)黑木耳蛋白水解效果的影響60-62
• 3.3 成骨細(xì)胞提取與鑒定62-65
• 3.3.1 成骨細(xì)胞提取..62-63
• 3.3.2 成骨細(xì)胞生長曲線.63
• 3.3.3 成骨細(xì)胞鑒定 .63-65
• 3.4 不同黑木耳多肽促成骨細(xì)胞增殖活性的影響65-69
• 3.4.1 酶解黑木耳多肽促成骨細(xì)胞增殖活性的影響65-67
• 3.4.2 堿解黑木耳多肽促成骨細(xì)胞增殖活性的影響67-68
• 3.4.3 最佳黑木耳多肽的篩選68-69
• 3.5 本章小結(jié)69-71
• 第4章 黑木耳多肽功能組分的純化71-76
• 4.1 黑木耳多肽純化結(jié)果及功能組分篩選71-72
• 4.2 功能組分AP-2 相對(duì)分子量的測(cè)定72-74
• 4.2.1 Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳法72-73
• 4.2.2 液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)分析法73-74
• 4.3 功能組分AP-2 氨基酸組成分析74-75
• 4.4 本章小結(jié)75-76
• 第5章 黑木耳多肽功能組分與鈣離子螯合工藝優(yōu)化76-86
• 5.1 肽鈣螯合工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-79
• 5.1.1 pH對(duì)肽鈣螯合效果的影響76-77
• 5.1.2 肽鈣螯合比對(duì)肽鈣螯合效果的影響77
• 5.1.3 螯合時(shí)間對(duì)肽鈣螯合效果的影響77-78
• 5.1.4 螯合溫度對(duì)肽鈣螯合效果的影響78-79
• 5.2 肽鈣螯合工藝的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果79-84
• 5.3 肽鈣螯合物紅外表征結(jié)果84-85
• 5.4 本章小結(jié)85-86
• 第6章 肽鈣螯合物對(duì)模擬微重力誘導(dǎo)骨流失的體外防護(hù)作用研究86-91
• 6.1 肽鈣螯合物對(duì)成骨細(xì)胞中蛋白含量的影響86-87
• 6.2 肽鈣螯合物對(duì)成骨細(xì)胞中鈣含量的影響87-88
• 6.3 肽鈣螯合物對(duì)成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶活力的影響88
• 6.4 肽鈣螯合物對(duì)成骨細(xì)胞中抗酒石酸酸性磷酸酶活力的影響88-89
• 6.5 本章小結(jié)89-91
• 第7章 肽鈣螯合物對(duì)模擬微重力誘導(dǎo)骨流失的體內(nèi)防護(hù)作用研究91-104
• 7.1 肽鈣螯合物對(duì)尾吊小鼠體重的影響91-93
• 7.1.1 各組雌性小鼠體重變化91-92
• 7.1.2 各組雄性小鼠體重變化92-93
• 7.2 肽鈣螯合物對(duì)尾吊小鼠免疫臟器的影響93-95
• 7.2.1 各組雌性小鼠免疫器官指數(shù)93-94
• 7.2.2 各組雄性小鼠免疫器官指數(shù)94-95
• 7.3 肽鈣螯合物對(duì)尾吊小鼠骨密度及股骨指數(shù)的影響95-97
• 7.3.1 各組雌性小鼠骨密度和股骨指數(shù)95-96
• 7.3.2 各組雄性小鼠骨密度和股骨指數(shù)96-97
• 7.4 肽鈣螯合物對(duì)尾吊小鼠股骨中無機(jī)物及有機(jī)物的影響97-99
• 7.4.1 肽鈣螯合物對(duì)尾吊小鼠股骨中無機(jī)物的影響97-98
• 7.4.2 肽鈣螯合物對(duì)尾吊小鼠股骨中有機(jī)物的影響98-99
• 7.5 肽鈣螯合物對(duì)尾吊小鼠血清中蛋白和鈣含量的影響99-101
• 7.5.1 各組小鼠血清中蛋白含量99-100
• 7.5.2 各組小鼠血清中鈣含量100-101
• 7.6 肽鈣螯合物對(duì)尾吊小鼠血清中骨代謝相關(guān)酶活力的影響101-102
• 7.6.1 各組小鼠血清中堿性磷酸酶活力101
• 7.6.2 各組小鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶活力101-102
• 7.7 本章小結(jié)102-104
• 結(jié)論104-106
• 參考文獻(xiàn)106-119
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文及其它成果119-121
• 致謝121

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本文編號(hào)：585037