本文關(guān)鍵詞：模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞的影響

  更多相關(guān)文章： 回轉(zhuǎn) 模擬失重 肺微血管內(nèi)皮細胞 細胞凋亡 細胞骨架 NO eNOS Akt Bcl-2 Bax P21~(Cipl)

【摘要】： 失重或模擬失重可導(dǎo)致肺循環(huán)功能失調(diào),血管結(jié)構(gòu)、功能的變化在其中具有重要作用。肺微血管內(nèi)皮細胞功能對于肺循環(huán)的正常功能維持具有重要作用,是構(gòu)成微血管通透性的主要物理屏障,不僅能保證微血管內(nèi)外正常的物質(zhì)交換,而且可分泌多種因子調(diào)節(jié)微血管的舒縮功能。失重或模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)、功能變化及其內(nèi)在機制并不清楚。因此,本課題的目的為： (1)觀察回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的影響； (2)研究回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞合成NO產(chǎn)量及eNOS蛋白表達的影響； (3)研究回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞骨架的影響； (4)研究回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響初步分子機制。 方法 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代肺微血管內(nèi)皮細胞,以倒置相差顯微鏡、Ⅷ因子免疫熒光染色、掃描電鏡和透射電鏡等方法對培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細胞進行鑒定；采用回轉(zhuǎn)器回轉(zhuǎn)細胞模擬失重,以掃描電鏡和透射電鏡法對回轉(zhuǎn)模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)變化進行觀察;以Griess法對培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細胞合成釋放的NO濃度進行檢測,以免疫組化技術(shù)和Western blot技術(shù)對肺微血管內(nèi)皮細胞中的eNOS蛋白表達進行檢測；以Annexin V-FITC和PI雙染標記細胞,采用流式細胞術(shù)及Hoechst33258細胞核染色對肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡進行檢測：采用免疫熒光標記技術(shù),以Texas Red-X偶聯(lián)的phalloidin標記肺微血管內(nèi)皮細胞微絲肌動蛋白,觀察回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞骨架的影響；采用放免技術(shù)檢測回轉(zhuǎn)模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細胞ET-1合成釋放量的變化,以Western blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測肺微血管內(nèi)皮細胞Akt磷酸化水平的變化及P21Cip1蛋白表達的變化；采用Western blot技術(shù)對凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax的表達進行檢測。 結(jié)果 掃描電鏡結(jié)果表明,回轉(zhuǎn)48h后,肺微血管內(nèi)皮細胞單層細胞之間的連接較為松散,可見有明顯的裂縫存在；而在同步對照組的肺微血管內(nèi)皮細胞單層可見細胞之間的連接較為緊密,未見裂縫或空洞存在,說明回轉(zhuǎn)模擬失重能夠破壞肺微血管內(nèi)皮細胞單層,導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細胞單層的通透性明顯增強。透射電鏡結(jié)果表明,回轉(zhuǎn)48小時后,可見肺微血管內(nèi)皮細胞中線粒體增生、腫脹。NO檢測及Western blot、免疫組化結(jié)果表明,回轉(zhuǎn)模擬失重可導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細胞的NO產(chǎn)量增加,同時增強eNOS蛋白的表達,并且這種增加存在時間依賴關(guān)系。Hoechst33258染色及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,回轉(zhuǎn)48h模擬失重肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡率明顯高于對照；phalloidin肺微血管內(nèi)皮細胞微絲肌動蛋白染色結(jié)果表明,回轉(zhuǎn)模擬失重可導(dǎo)致微絲細胞骨架隨著回轉(zhuǎn)時間的延長出現(xiàn)進行性的解聚：回轉(zhuǎn)48h后,放免結(jié)果表明肺微血管內(nèi)皮細胞合成釋放ET-1的量下降；Western blot及免疫熒光染色結(jié)果表明,Akt磷酸化水平下降,而P21Cip1蛋白表達增強;Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果表明,回轉(zhuǎn)模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下降,而促凋亡蛋白Bax表達顯著升高。 結(jié)論 (1)回轉(zhuǎn)模擬失重可導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細胞中線粒體增生、腫脹;破壞肺微血管內(nèi)皮細胞單層,導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細胞單層的通透性明顯增強； (2)回轉(zhuǎn)模擬失重可刺激肺微血管內(nèi)皮細胞中NO的合成和釋放,增強eNOS蛋白的表達,并且這種eNOS表達的增強和NO產(chǎn)量的增加與回轉(zhuǎn)模擬失重的時間長短呈正相關(guān)； (3)回轉(zhuǎn)模擬失重可導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細胞發(fā)生早期凋亡； (4)回轉(zhuǎn)模擬失重可導(dǎo)致PMVEC內(nèi)微絲細胞骨架發(fā)生解聚; (5)回轉(zhuǎn)模擬失重導(dǎo)致了肺微血管內(nèi)皮細胞ET-1合成分泌下降及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放增加；抑制肺微血管內(nèi)皮細胞中Akt的磷酸化水平,增強P21Cip1蛋白的核內(nèi)表達水平；抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達,增強了促凋亡蛋白Bax的表達。
【關(guān)鍵詞】：回轉(zhuǎn) 模擬失重 肺微血管內(nèi)皮細胞 細胞凋亡 細胞骨架 NO eNOS Akt Bcl-2 Bax P21~(Cipl)
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R855.22
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 參考文獻16-19
• 第一部分 肺微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)、鑒定及超微結(jié)構(gòu)觀察19-30
• 1. 材料與方法19-22
• 2. 結(jié)果22-27
• 3. 討論27-29
• 參考文獻29-30
• 第二部分 模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞eNOS表達及NO產(chǎn)生的影響30-42
• 1. 材料與方法30-36
• 2. 結(jié)果36-39
• 3. 討論39-40
• 參考文獻40-42
• 第三部分 模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響42-49
• 1.材料與方法42-44
• 2. 結(jié)果44-45
• 3. 討論45-47
• 參考文獻47-49
• 第四部分 模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞F-actin的影響49-55
• 1 材料和方法49-50
• 2 結(jié)果50-52
• 3 討論52-54
• 參考文獻54-55
• 第五部分 模擬失重下肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡的初步機制研究55-73
• 1. 材料與方法55-61
• 2. 結(jié)果61-66
• 3. 討論66-70
• 參考文獻70-73
• 結(jié)論73-74
• 文獻綜述74-82
• 模擬失重對肺血管內(nèi)皮細胞影響研究進展74-79
• 參考文獻79-82
• 博士期間發(fā)表的文章82-83
• 致謝83

【參考文獻】

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本文編號：566479