本文關(guān)鍵詞：類泛素蛋白NEDD8賴氨酸功能研究和修飾底物鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的:泛素樣蛋白NEDD8(Neural-precursor-cell-Expressed Developmentally Down-regulated 8)是最重要的類泛素化蛋白之一,其與底物蛋白的結(jié)合過程稱為neddylation。Neddylation修飾與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控等高度相關(guān)。泛素的7個(gè)賴氨酸可以形成不同的泛素鏈結(jié)構(gòu),在各種生化過程中發(fā)揮著重要的作用。然而NEDD8上不同賴氨酸的功能至今尚未被研究。本課題中,我們將NEDD8中的各個(gè)賴氨酸分別突變成精氨酸,從而獲得9個(gè)NEDD8突變體,研究了NEDD8上賴氨酸的潛在功能。作為E3泛素連接酶的一個(gè)組成蛋白,cullins是最早被發(fā)現(xiàn)可被NEDD8修飾的底物蛋白,cullins的neddylation修飾可以激活cullin-RING E3(CRL E3)泛素連接酶的活性。相比泛素修飾的底物蛋白研究,NEDD8修飾底物蛋白的研究少之又少。本課題中,我們通過親和層析方法來分離富集NEDD8修飾的底物蛋白,并用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。方法:構(gòu)建將各個(gè)賴氨酸分別突變成精氨酸的9個(gè)NEDD8突變體,在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)NEDD8野生型和突變體,免疫印跡在全蛋白液中檢測各個(gè)突變體對neddylation修飾的影響,找到關(guān)鍵賴氨酸;共轉(zhuǎn)染NEDD8野生型、突變體與NEDD8激活酶NAE1/Uba3、結(jié)合酶UBE2M,免疫印跡檢測關(guān)鍵賴氨酸的突變對NEDD8的激活、結(jié)合過程的影響;共轉(zhuǎn)染NEDD8野生型、突變體與cullins家族蛋白,純化cullins后免疫印跡檢測關(guān)鍵賴氨酸的突變對底物蛋白neddylation修飾及泛素修飾的影響;共轉(zhuǎn)染NEDD8野生型、突變體與cullins家族成員與CRL E3泛素連接酶底物,純化CRL E3泛素連接酶底物后免疫印跡檢測關(guān)鍵賴氨酸的突變對底物蛋白泛素化的影響;大量過表達(dá)帶His6親和標(biāo)簽的NEDD8,通過標(biāo)簽親和純化NEDD8修飾蛋白,胰蛋白酶酶解后獲得多肽片段,用質(zhì)譜分析獲得其底物蛋白。結(jié)果:(1)K27R NEDD8突變體抑制了蛋白質(zhì)neddylation修飾。(2)K27R NEDD8未影響NEDD8的激活過程。(3)K27R NEDD8突變體通過與NEDD8結(jié)合酶UBE2M形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵,影響了NEDD8的結(jié)合過程。(4)K27R NEDD8突變體影響了cullins的neddylation修飾。(5)K27R NEDD8突變體也影響了cullins的泛素化修飾。(6)K27R NEDD8突變體大大降低了cullin RING E3泛素連接酶底物I?B?的泛素化修飾。(7)質(zhì)譜分析共鑒定了84種NEDD8修飾蛋白,其中67種是新鑒定到的潛在NEDD8修飾底物蛋白,如染色體濃縮調(diào)節(jié)蛋白RCC等蛋白。結(jié)論:我們在NEDD8中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)影響底物蛋白neddylation修飾的賴氨酸。NEDD8第27位賴氨酸的突變可以抑制neddylation修飾。其作用機(jī)制為K27R NEDD8突變體與結(jié)合酶UBE2M形成了某種穩(wěn)定的共價(jià)鍵,從而無法與UBE2M形成硫酯鍵,進(jìn)而阻斷neddylation的下游進(jìn)程。K27R NEDD8突變體可以抑制cullins的neddylation修飾與泛素化修飾,從而影響了cullins相關(guān)的E3泛素連接酶的活性及其底物蛋白質(zhì)的泛素化。K27R NEDD8突變體在研究蛋白質(zhì)neddylation修飾的生化功能中可以作為重要的顯性負(fù)性突變體;NEDD8潛在底物的鑒定預(yù)示NEDD8或許參與細(xì)胞周期等某些重要生理反應(yīng)的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：NEDD8 neddylation cullins cullin-RING E3泛素連接酶 泛素化
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 NEDD8 突變體通過阻斷neddylation酶促反應(yīng)抑制CRL E3 泛素連接酶的活性13-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料13-16
• 2.1.1 細(xì)胞系13
• 2.1.2 主要試劑13-14
• 2.1.3 主要儀器14-15
• 2.1.4 主要抗體15-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-27
• 2.2.1 主要試劑的配制16-19
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)19-20
• 2.2.3 RNA提取20
• 2.2.4 第一鏈cDNA合成20-21
• 2.2.5 3XHA-NEDD8 質(zhì)粒的構(gòu)建21-23
• 2.2.6 3XHA-NEDD8 突變體的構(gòu)建23-24
• 2.2.7 E1、E2、E3 和底物質(zhì)粒的構(gòu)建24-26
• 2.2.8 PEI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染26
• 2.2.9 蛋白免疫印跡26
• 2.2.10 免疫共沉淀26-27
• 2.2.11 Strep-Tactin樹脂純化蛋白27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-41
• 2.3.1 NEDD8 結(jié)構(gòu)序列分析27-29
• 2.3.2 K27R NEDD8 突變體抑制蛋白質(zhì)neddylation修飾29-30
• 2.3.3 K27R NEDD8 突變體未影響NEDD8 的激活過程30-32
• 2.3.4 K27R NEDD8 突變體影響了NEDD8 的結(jié)合過程32-34
• 2.3.5 驗(yàn)證UBE2M與K27R NEDD8 突變體的結(jié)合34-35
• 2.3.6 驗(yàn)證Cul1、Cul4A與NEDD8 的表達(dá)35-36
• 2.3.7 驗(yàn)證Cul1 和Cul4A蛋白純化效果36
• 2.3.8 K27R NEDD8 突變體抑制cullins的neddylation36-37
• 2.3.9 K27R NEDD8 突變體抑制cullins的泛素化修飾37-38
• 2.3.10 K27R NEDD8 突變體影響了Cullin RING E3 泛素連接酶底物IkBa 的泛素化修飾38-39
• 2.3.11 K27R NEDD8 突變體抑制NEDD8 酶促級聯(lián)反應(yīng)的可能機(jī)制39-41
• 2.4 討論41-42
• 第三章 類泛素蛋白NEDD8 修飾底物鑒定42-56
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 3.1.1 細(xì)胞系42
• 3.1.2 主要試劑42
• 3.1.3 主要儀器42-43
• 3.1.4 主要抗體43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法43-47
• 3.2.1 主要試劑的配制43-45
• 3.2.2 目的基因His6-NEDD8 質(zhì)粒的構(gòu)建45
• 3.2.3 磷酸鈣轉(zhuǎn)染45
• 3.2.4 變性條件下用TALON樹脂純化His6標(biāo)簽蛋白45
• 3.2.5 銀染45-46
• 3.2.6 溶液內(nèi)酶解46
• 3.2.7 C18 除鹽純化46
• 3.2.8 LC-MS/MS檢測46-47
• 3.2.9 數(shù)據(jù)分析47
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-53
• 3.3.1 驗(yàn)證目標(biāo)蛋白純化效率47-48
• 3.3.2 驗(yàn)證酶解效率48
• 3.3.3 質(zhì)譜鑒定NEDD8 修飾蛋白的分布48-49
• 3.3.4 NEDD8 修飾底物蛋白的鑒定49-51
• 3.3.5 NEDD8 修飾蛋白的生物信息學(xué)分析51-53
• 3.4 討論53-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 綜述 類泛素化修飾neddylation的功能研究進(jìn)展60-69
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文69-70
• 中英語縮略詞對照表70-71
• 致謝71-72

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  本文關(guān)鍵詞：類泛素蛋白NEDD8賴氨酸功能研究和修飾底物鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：404022