本文關(guān)鍵詞：3-溴丙酮酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)毒性和代謝的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本論文通過(guò)用不同濃度的3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans,C.elegans),觀(guān)察藥物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)毒性效應(yīng)、幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間的影響、脂肪含量的影響及主要相關(guān)的己糖激酶基因和cyp-35家族基因表達(dá)水平的變化;并通過(guò)應(yīng)用目的基因RNA干擾線(xiàn)蟲(chóng)和突變株線(xiàn)蟲(chóng),研究3-溴丙酮酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的毒性和代謝的影響。方法:用不同濃度的3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng),在普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察線(xiàn)蟲(chóng)的形態(tài)及幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間的變化;抽提線(xiàn)蟲(chóng)總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR,選擇與3-溴丙酮酸毒性和代謝相關(guān)的基因—己糖激酶和cyp-35家族基因,測(cè)定相關(guān)基因的表達(dá)水平。克隆表達(dá)3個(gè)己糖激酶基因用于RNA干擾,同時(shí)應(yīng)用藥物代謝相關(guān)基因RNA干擾線(xiàn)蟲(chóng)和突變株線(xiàn)蟲(chóng)探討3-溴丙酮酸在線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的毒性及代謝機(jī)制。結(jié)果:1.2mmol/L的3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng),幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間明顯延長(zhǎng),與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.不同濃度的3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)24h后,記錄線(xiàn)蟲(chóng)成活個(gè)數(shù),用SPSS19.0軟件計(jì)算出藥物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的半數(shù)致死濃度為12.7mmol/L。3.3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)24小時(shí)后,線(xiàn)蟲(chóng)的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞均未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。4.3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)72小時(shí)后,線(xiàn)蟲(chóng)頭部和腸道的脂肪儲(chǔ)存增加。5.3-溴丙酮酸處理線(xiàn)蟲(chóng)后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果顯示hxk-1、hxk-2和hxk-3的表達(dá)上調(diào)。6.應(yīng)用RNA干擾的方法沉默目的基因hxk-1、hxk-2、hxk-3,其中hxk-1、hxk-2干擾效果較好。3-溴丙酮酸作用于hxk-1、hxk-2和hxk-3干擾線(xiàn)蟲(chóng),LC50均降低。7.通過(guò)MEGA5.05軟件和Clustal W軟件對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)己糖激酶基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化相似性比較,秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)hxk-1與美洲板口線(xiàn)蟲(chóng)己糖激酶屬于一個(gè)分支,遺傳近似度較高。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)hxk-2和hxk-3是一個(gè)分支,hxk-2和hxk-3近似度較高,與hxk-1遺傳近似度較低。8.3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果顯示cyp-35A1、cyp-35A2、cyp-35A4、cyp-35A5和cyp-35C1表達(dá)量均升高,其中cyp-35A1表達(dá)量升高最明顯,CYP35家族中cyp-35B3表達(dá)量降低。9.3-溴丙酮酸作用于cyp-35A1突變株線(xiàn)蟲(chóng)、cyp-35A2突變株線(xiàn)蟲(chóng)、cyp-35A4RNA干擾線(xiàn)蟲(chóng)和cyp-35B3 RNA干擾線(xiàn)蟲(chóng)后,LC50均降低。結(jié)論:高濃度的3-溴丙酮酸對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)具有毒性作用,低濃度的3-溴丙酮酸能抑制秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育,且具有濃度依賴(lài)性。線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)與3-溴丙酮酸作用相關(guān)的己糖激酶基因表達(dá)均有不同程度的上調(diào),說(shuō)明當(dāng)3-溴丙酮酸抑制己糖激酶的活性時(shí),線(xiàn)蟲(chóng)ATP產(chǎn)生減少,糖酵解通路反饋調(diào)節(jié)己糖激酶基因高表達(dá),以合成更多的己糖激酶。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)hxk-2和hxk-3遺傳近似度較高,與hxk-1遺傳近似度較低。參與3-溴丙酮酸藥物代謝的細(xì)胞色素P450家族中cyp-35A1基因表達(dá)明顯上調(diào),其可能是秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)調(diào)控3-溴丙酮酸代謝的主要基因;而cyp-35B3基因表達(dá)下調(diào),說(shuō)明3-溴丙酮酸能夠抑制cyp-35B3的表達(dá),或cyp-35A1上調(diào)表達(dá)影響cyp-35B3的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng) 3-溴丙酮酸 己糖激酶 細(xì)胞色素P450 cyp-35
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R965
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-19
• 1.1 模式生物秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)簡(jiǎn)介10-11
• 1.2 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在藥物毒理和藥物代謝方面的研究進(jìn)展11-15
• 1.2.1 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在藥物毒理學(xué)方面的應(yīng)用11-12
• 1.2.2 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞色素P450的研究進(jìn)展12-14
• 1.2.3 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)cyp-35 家族基因的研究進(jìn)展14-15
• 1.3 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)RNA干擾的原理和應(yīng)用15-16
• 1.3.1 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)RNA干擾的原理15-16
• 1.3.2 RNA干擾技術(shù)在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的應(yīng)用16
• 1.4 3-溴丙酮酸的研究現(xiàn)狀16-19
• 1.4.1 3-溴丙酮酸的藥物特點(diǎn)和作用機(jī)制16-18
• 1.4.2 3-溴丙酮酸的研究進(jìn)展18-19
• 第二章 材料和方法19-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器19-21
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑19
• 2.1.3 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配制19-20
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備20-21
• 2.2 試驗(yàn)方法21-32
• 2.2.1 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)21
• 2.2.2 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的同步化和保存21
• 2.2.3 3-溴丙酮酸作用于秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)21-22
• 2.2.4 吖啶橙染色藥物處理后的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)22
• 2.2.5 對(duì)藥物處理的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行脂肪染色22-23
• 2.2.6 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄23-24
• 2.2.7 hxk-1、hxk-2 和hxk-3 引物設(shè)計(jì)和表達(dá)量的測(cè)定24-25
• 2.2.8 目的基因hxk-1、hxk-2 和hxk-3 基因的克隆25-28
• 2.2.9 目的基因hxk-1、hxk-2 和hxk-3 基因的表達(dá)28-29
• 2.2.10 目的基因hxk-1、hxk-2 和hxk-3 的沉默和RNA干擾效果驗(yàn)證29
• 2.2.11 3-溴丙酮酸作用于hxk-1、hxk-2 和hxk-3 基因沉默的線(xiàn)蟲(chóng)29-30
• 2.2.12 己糖激酶基因分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建及親緣關(guān)系分析30
• 2.2.13 cyp-35A1、cyp-35A2、cyp-35A4、cyp-35A5、cyp-35B3和cyp-35C1引物的設(shè)計(jì)與表達(dá)量的測(cè)定30-31
• 2.2.14 cyp-35A4和cyp-35B3基因沉默線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)31
• 2.2.15 3-溴丙酮酸作用于cyp-35A1、cyp-35A2、cyp-35A4和cyp-35B3基因沉默或突變株線(xiàn)蟲(chóng)31
• 2.2.16 數(shù)據(jù)分析31-32
• 第三章 結(jié)果32-44
• 3.1 3-溴丙酮酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)毒性作用觀(guān)察32-35
• 3.1.1 3-溴丙酮酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)毒性作用的形態(tài)觀(guān)察32
• 3.1.2 3-溴丙酮酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果32
• 3.1.3 3-溴丙酮酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育的影響32-33
• 3.1.4 3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)后細(xì)胞凋亡染色結(jié)果33-34
• 3.1.5 3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)后脂肪染色結(jié)果34-35
• 3.2 3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)后己糖激酶基因的表達(dá)35-41
• 3.2.1 3-溴丙酮酸作用線(xiàn)蟲(chóng)后總RNA的提取35
• 3.2.2 hxk-1、hxk-2 和hxk-3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果35-36
• 3.2.3 目的基因hxk-1、hxk-2 和hxk-3 克隆結(jié)果36-39
• 3.2.4 hxk-1、hxk-2 和hxk-3 基因RNA干擾效果驗(yàn)證39
• 3.2.5 3-溴丙酮酸對(duì)hxk基因RNA干擾線(xiàn)蟲(chóng)的毒力結(jié)果39-40
• 3.2.6 己糖激酶基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果40-41
• 3.3 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)cyp-35 家族基因?qū)?3-溴丙酮酸代謝的研究41-44
• 3.3.1 cyp-35A1、cyp-35A2、cyp-35A4、cyp-35A5、cyp-35B3和cyp-35C1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果41-43
• 3.3.2 3-溴丙酮酸對(duì)不同基因RNA干擾線(xiàn)蟲(chóng)或突變株線(xiàn)蟲(chóng)的毒力結(jié)果43-44
• 第四章 討論44-48
• 4.1 3-溴丙酮酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育的影響44
• 4.2 3-溴丙酮酸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)毒性機(jī)制的探討44-45
• 4.3 cyp-35 家族基因在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)藥物代謝機(jī)制中的作用45-48
• 第五章 結(jié)論48-49
• 5.1 主要結(jié)論48
• 5.2 研究展望48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 在學(xué)期間的研究成果53-54
• 附錄一 英語(yǔ)縮略詞匯表54-55
• 致謝55

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本文編號(hào)：376417