發(fā)布時間：2017-05-15 13:00

  本文關鍵詞：miR-218調控小鼠胚胎干細胞體外定向分化心肌細胞研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：microRNAs (miRNAs)是存在于真核生物中具有調控功能的內源性非編碼RNA,大小通常為19-25個長度的核苷酸。研究表明,miRNA通過堿基互補配對原理調控靶基因mRNA表達,參與調節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移、脂肪代謝及胚胎器官形成等多種生理功能。miR-218 (miRNA-218)是一種首先被發(fā)現(xiàn)在中樞神經系統(tǒng)中有高表達的miRNA,目前關于miR-218的研究主要集中在惡性膠質細胞瘤,miR-218可以通過調節(jié)不同靶基因參與調控膠質瘤細胞的侵襲、遷移、增殖及腫瘤干細胞的全能性,這已成為惡性膠質細胞瘤臨床研究的一個熱點。而在心臟發(fā)育領域,近幾年僅有少量關于miR-218相關研究報道。在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中,miR-218可以通過與Tbx5之間互相調控而影響心臟發(fā)育,miR-218表達被抑制后可以抵消部分由于TBX5過表達后引起的心臟循環(huán)發(fā)育阻滯。過表達miR-218后可引起斑馬魚胚胎心臟發(fā)育畸形、心房發(fā)育不全、心室間隔無法正常形成等現(xiàn)象。但miR-218可能調控的靶基因及參與心肌細胞分化的作用機制尚未完全闡明。并且斑馬魚細胞中miR-218分型與哺乳動物細胞中miR-218分型不同,斑馬魚細胞中miR-218不同亞型參與心臟發(fā)育不同過程的調控。因此,亟待在哺乳動物胚胎發(fā)育代表性強的體系中加以研究。小鼠胚胎干(embryonic stem, ES)細胞自首次從小鼠胚囊內層細胞中發(fā)現(xiàn)后,因可以在體外適宜條件下無限制增殖并具有分化成所有體細胞的全能性而在各種研究中得到廣泛應用。已有報道m(xù)iR-1和miR-133參與調控胚胎心肌分化發(fā)育及心血管的形成,Let-7家族也可參與調控心血管疾病的發(fā)生及ES細胞定向心肌分化過程。miR-218參與調控ES細胞全能性的維持。另在口腔鱗狀細胞癌中miR-218通過靶基因Rictor參與調控腫瘤的發(fā)生和遷移。而干細胞與腫瘤細胞之間存在著驚人的相似性,因此,影響腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等功能的某些信號調控網絡,在控制干細胞功能中同樣發(fā)揮著重要作用。ES細胞體外定向心肌細胞分化過程伴隨著細胞遷移運動,擬胚體(embryonid bodies, EBs)的形成過程模擬了ES細胞體內形成三胚層原腸胚的過程,其中涉及包括細胞的分裂增殖,遷移,聚集和重排在內的一系列形態(tài)發(fā)生運動。有文獻表明,miR-124參與EBs形成過程中細胞遷移的調控,miR-124表達上調后抑制EB鋪展以及ES細胞遷移,并抑制ES細胞分化。miR-218可以通過靶基因Robol調控Slit/Robol信號通路,并調節(jié)遷移相關蛋白Cdc42和黏附相關蛋白Rac1的表達,影響惡性膠質細胞瘤細胞的遷移。但迄今尚未見有關miR-218對ES細胞定向分化心肌細胞及分化中伴隨的細胞遷移作用報道。因此,本研究主要利用小鼠ES細胞體外定向分化為心肌細胞模型,探索miR-218在ES細胞定向心肌細胞分化過程中的調控作用,并進一步采用生物信息學方法,通過miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫如Targetscan、miRanda、Pictar等,對特定miRNA可能的靶基因進行序列分析及預測,并采用miRNA分析數(shù)據(jù)庫如miRPath. Tarbase和MicroT-CDS等對靶基因進行功能分類,并利用PCR法對預測結果進行基因表達水平的鑒定。旨在闡明miR-218表達調控與ES細胞分化為心肌細胞間的關系,揭示miR-218潛在可能參與調控心肌分化過程的靶基因,為深入研究miR-218在ES細胞分化中的作用機制提供實驗依據(jù)。目的：探索miR-218對小鼠ES細胞定向分化心肌細胞的調控作用及miR-218潛在可能參與調控心肌細胞分化的靶基因。闡明miR-218表達調控與ES細胞分化為心肌細胞間的相關性,揭示ES細胞分化過程中miR-218轉錄后調控分子信息。實驗方法：采用經典的“懸滴培養(yǎng)-懸浮培養(yǎng)-貼壁培養(yǎng)”三步法ES細胞定向心肌細胞分化模型,利用miR-218擬似物(miR-218 mimic)和miR-218抑制劑(miR-218 inhibitor)分別轉染小鼠ES細胞,檢測搏動心肌細胞團分化率變化,并運用免疫印跡技術、流式細胞術和免疫熒光染色法檢測小鼠ES細胞中miR-218的表達調控與心肌細胞定向分化過程中心肌特異性轉錄因子及心肌細胞特異性蛋白水平的表達,心肌細胞數(shù)量,鈣離子通道相關蛋白表達變化及心肌肌小節(jié)成熟結構的形成情況。采用活細胞工作站測定分化來的心肌細胞內質網Ca2+瞬變。通過生物信息學分析ES細胞中可能與miR-218互補結合的靶基因序列,并運用RT-PCR及qRT-PCR檢測miR-218 mimic對部分預測出可能靶基因的表達水平影響。根據(jù)預測結果,進而利用劃痕法和Transwell法檢測miR-218對ES細胞體外分化中伴隨的遷移現(xiàn)象的調控作用,并用免疫印跡技術探究miR-218對ES細胞定向心肌分化過程中細胞遷移相關蛋白的影響。實驗結果：1. miR-218 mimic轉染小鼠ES細胞后,抑制心肌細胞分化,在day 5+2和day 5+3時心肌細胞分化率分別為12±3%和32±7%,較陰性對照組29±4%和56±5%顯著減少(P0.01)。中胚層特異性標記蛋白brachyury,心肌特異性轉錄因子Nkx2.5、GATA4、TBX5,肌小節(jié)結構蛋白a-Actinin,竇房結樣心肌細胞特異性蛋白HCN4,心房樣心肌細胞特異性蛋白ANP及心室樣心肌細胞特異性蛋白MLC-2v,橋粒蛋白Desmoplakin,間隙連接蛋白Cx43和鈣相關蛋白N-cadherin的表達均呈現(xiàn)顯著性下降。同時,miR-218 mimic顯著降低day 5+3心肌細胞內咖啡因刺激后Ca2+瞬變幅度。流式細胞術檢測結果顯示,ES細胞轉染miR-218 mimic后分化成心肌細胞數(shù)量減少。并且,免疫熒光結果顯示miR-218 mimic組分化而來的心肌細胞肌小節(jié)結構紊亂。而miR-218 inhibitor轉染ES細胞后,能促進心肌細胞分化時相提前。在day 5+1時就出現(xiàn)搏動心肌細胞團,分化率為4±3%。在day 5+2和day 5+3時心肌細胞分化率分別為68±4%和84±8%,較陰性對照組29±5%和56±7%顯著增加(P0.01)。miR-218 inhibitor促進中胚層特異性標記蛋白brachyury的表達,Nkx2.5、GATA4、TBX5、α-Actinin、HCN4、ANP、MLC-2v、L-type Ca2+ CPα1D、 CaMKIIδ、Desmoplakin、Cx43和N-cadherin蛋白表達水平均上調。miR-218 inhibitor增加α-Actinin陽性表達的心肌細胞數(shù),且促進分化而來的細胞肌小節(jié)結構清晰完整,顯著提高day 5+3心肌細胞內Ca2+瞬變幅度。2.生物信息學方法預測分析出164個miR-218的可能靶基因,經miRNA功能分析數(shù)據(jù)庫miRPath發(fā)現(xiàn)miR-218參與調控20條信號通路。結合預測結果及文獻報道,選擇了其中四條與心肌分化相關的信號通路中部分靶基因進行基因水平的驗證,具體包括磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)(Phosphatidylinositol signaling system),谷氨酸的突觸調控通路(Glutamatergic synapse),細胞間連接(Gap junction)和mTOR信號調控系統(tǒng)中的Rictor、Pik3r1、Pi4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grml 和 Gnai2。PCR結果顯示,miR-218 mimic可以顯著下調Rictor、Pik3r1、Shank2、 Pdgfr-α、Grm1基因水平的表達。3.基于miR-218靶基因預測并驗證出的靶基因Pdgfr-α、Grml和Rictor,結合文獻報道,其可以參與心肌分化發(fā)育調控,并調控腫瘤細胞遷移,同時細胞遷移在小鼠ES細胞定向心肌分化發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要的作用,本實驗對miR-218表達與小鼠ES細胞心肌分化中的遷移能力調控進行了進一步的探究。在小鼠ES細胞定向心肌細胞分化過程中,miR-218 mimic組EBs鋪展遷移最遠細胞距EBs邊緣的平均距離為431.1μm,顯著大于對照組EBs細胞遷移平均距離350.1μm, miR-218表達上調促進EBs細胞遷移,miR-218 inhibitor組EBs細胞遷移距離為235.9μm,顯著小于對照組遷移距離318.7μm。體外劃痕實驗結果顯示,miR-218 mimic轉染后ES細胞遷移距離在12 h和24 h較陰性對照組都有顯著增加,劃痕愈合面積比增大。Transwell實驗結果顯示,miR-218 mimic組平均每個視野遷移的ES細胞數(shù)目為180個,較陰性對照組的120個顯著增加,提示miR-218mimic具有促進小鼠ES細胞體外遷移作用。該作用可能與miR-218通過下調靶基因Grm1,Pdgfr-α及Rictor的表達,進而抑制細胞遷移相關蛋白Rac1和Cdc42表達有關。結論：1.在小鼠ES細胞體外定向分化為心肌細胞過程中,miR-218表達量與心肌分化密切相關,miR-218 mimic可抑制ES細胞定向中胚層分化,抑制心肌細胞分化。而miR-218 inhibitor的作用則相反。2.通過生物信息學方法預測發(fā)現(xiàn)miR-218可能參與細胞內20條信號通路的164個基因的表達調控。其中與心肌分化相關的4條信號通路中,miR-218 mimic可以顯著下調Rictor、Pik3r1、shank2、Pdgfr-α、Grm1基因水平的表達,可作為miR-218調控ES細胞定向分化心肌細胞作用機制的重要靶點進行深入研究。3.miR-218表達量與ES細胞定向心肌分化過程中EB細胞的鋪展能力相關,miR-218 mimic可以促進ES細胞的體外遷移能力,miR-218 inhibitor的作用則相反。miR-218參與ES細胞遷移的調控作用可能與調節(jié)靶基因Grml、Pdgfr-α和Rictor表達,影響細胞遷移相關蛋白Racl和Cdc42表達有關。
【關鍵詞】：miR-218 ES細胞 心肌細胞 定向分化 遷移
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R965
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-11
• Abstract11-17
• 論文創(chuàng)新點17-18
• 縮略詞表18-21
• 引言21-25
• 實驗儀器和材料25-28
• 1 動物、細胞株25
• 2 儀器25
• 3 儀器及耗材25-26
• 4 溶液的配制26-28
• 實驗方法28-36
• 1 細胞培養(yǎng)28-29
• 1.1 原代小鼠胚胎成纖維細胞制備28
• 1.2 飼養(yǎng)層的制備28
• 1.3 小鼠ES細胞的支持培養(yǎng)28-29
• 2 miRNA轉染ES細胞及分化培養(yǎng)29
• 2.1 miR-218 mimic/inhibitor轉染29
• 2.2 懸滴培養(yǎng)29
• 2.3 懸浮培養(yǎng)29
• 2.4 貼壁培養(yǎng)29
• 3 Western blotting檢測蛋白表達29-30
• 3.1 總蛋白提取30
• 3.2 蛋白印跡實驗30
• 4 實時定量PCR30-31
• 5 RT-PCR基因表達檢測31-32
• 6 免疫熒光染色法檢測心肌特異性蛋白α-Actinin的表達32-33
• 7 流式細胞術定量檢測miR-218 mimic/inhibitor對心肌特異性蛋白表達的影響33
• 8 ES細胞分化為心肌細胞內鈣瞬變測定33-34
• 8.1 試劑配制33
• 8.2 鈣瞬變檢測33-34
• 9 細胞遷移34
• 9.1 EBs中細胞遷移34
• 9.2 細胞劃痕實驗檢測miR-218 mimic/inhibitor對ES細胞遷移能力的影響34
• 9.3 Transwell細胞遷移實驗34
• 10 靶基因預測及通路分析34-35
• 11 數(shù)據(jù)分析35-36
• 第一部分 miR-218表達調控對小鼠ES細胞定向分化為心肌細胞的影響36-48
• 1 實驗結果36-46
• 1.1 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠ES細胞定向心肌細胞分化率的影響36-37
• 1.2 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠ES細胞分化為心肌細胞肌小節(jié)結構的影響37-38
• 1.3 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠ES細胞分化為心肌細胞數(shù)量的影響38-39
• 1.4 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠ES細胞衍生心肌細胞鈣瞬變的影響39-40
• 1.5 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠ES細胞分化為EBs時中胚層形成的影響40-41
• 1.6 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠ES細胞定向分化為心肌細胞中早期心肌特異性轉錄因子蛋白及基因表達的影響41-42
• 1.7 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠ES細胞定向分化為心肌細胞中心肌特異性蛋白表達的影響42-44
• 1.8 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠ES細胞體外定向分化的心肌細胞中心肌功能調控相關蛋白表達的影響44-46
• 2 討論46-47
• 3 小結47-48
• 第二部分 miR-218在小鼠ES細胞定向心肌分化過程中對靶向基因調控作用研究48-63
• 1 實驗結果48-59
• 1.1 miR-218靶基因預測和通路分析48-53
• 1.2 miR-218 mimic/inhibitor在小鼠ES細胞體外定向心肌分化過程中對Rictor、Pik3r1、Pi4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grml和Gnai2基因水平表達的影響53-54
• 1.3 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠EBs細胞體外遷移的影響54-55
• 1.4 miR-218 mimic/inhibitor對ES細胞體外遷移的影響55-58
• 1.5 miR-218 mimic/inhibitor對小鼠ES細胞遷移相關蛋白表達的影響58-59
• 2 討論59-62
• 3 小結62-63
• 總結63-64
• 參考文獻64-74
• 綜述 miRNA調控胚胎干細胞自我更新及分化的研究進展74-86
• 參考文獻78-86
• 作者簡歷及在讀期間所取得研究成果86-87

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