本文關(guān)鍵詞：多功能納米抗體的構(gòu)建及其抗腫瘤機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自從抗CD20抗體-利妥昔單抗1997年被FDA批準(zhǔn)上市以來(lái),已經(jīng)超過(guò)數(shù)十種抗體被用來(lái)治療腫瘤。盡管單克隆抗體在治療腫瘤方面取得一定的療效,但其效果溫和。為了提高抗體的治療效果,研究者們將抗體與化療藥物、毒素、免疫因子、放射性核素等制備成復(fù)合物,或者通過(guò)融合蛋白技術(shù)制備成多功能抗體。但是這些抗體劑型仍然存在著一些不足,如細(xì)胞毒性更高,瘤內(nèi)富集程度較低,機(jī)制不明,容易產(chǎn)生耐藥等問(wèn)題。近年來(lái),納米醫(yī)藥由于具有EPR效應(yīng)能夠顯著增強(qiáng)藥物的瘤內(nèi)富集而成為抗腫瘤的研究熱點(diǎn)。目前基于納米技術(shù)的靶向治療主要集中在抗體介導(dǎo)的靶向體系。而圍繞抗體結(jié)構(gòu)組成本身,利用納米技術(shù),構(gòu)建新型納米尺度的抗體(nano antibody,nAb)研究卻很少。本課題組前期通過(guò)納米技術(shù)將I和II型兩種抗CD20抗體偶聯(lián)制備納米抗體團(tuán)簇,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其相比于游離的抗體而言,抗體團(tuán)簇誘導(dǎo)凋亡的能力大大增強(qiáng)。我們認(rèn)為該額外凋亡的增加來(lái)源于胞外抗原交聯(lián)�；诖�,我們猜想:進(jìn)一步交聯(lián)或者受限靶細(xì)胞上CD20分子能否促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)?在本課題中,我們通過(guò)化學(xué)合成將I型抗CD20抗體連接不同鏈長(zhǎng)高分子上(PEIn-R,n=1.8,10,25,50,750 kDa),實(shí)現(xiàn)不同程度的抗原交聯(lián);同時(shí),將抗體偶聯(lián)到一個(gè)具有溫敏功能的高分子長(zhǎng)鏈(PI-4-R),該溫敏高分子poly(N-isopropylacrylamide)(PNIPAM)具有最低臨界溶解溫度(Lower critical solution temperature,LCST),其鏈隨著溫度的升高而收縮,可以實(shí)現(xiàn)抗原的進(jìn)一步受限。動(dòng)靜態(tài)散射儀(Dynamic/static laser light scattering,DLLS/SLLS),透射電子顯微鏡(TEM)及SDS-PAGE蛋白電泳膠等手段均證實(shí)不同鏈長(zhǎng)PEI-R及PI-4-R成功合成,具有明顯的類(lèi)似梳狀的結(jié)構(gòu)。且相比單獨(dú)的PI-4載體,接上抗體之后的PI-4-R的LCST提高了接近2℃,這主要是因?yàn)镻I-4鏈上接上大量親水性抗體之后,與水分子間的作用力增強(qiáng),所以相轉(zhuǎn)變溫度出現(xiàn)相應(yīng)的提高,這也從間接說(shuō)明PI-4成功與CD20抗體連接。每個(gè)納米抗體鏈上偶聯(lián)的抗體數(shù)目在SLLS上得到進(jìn)一步的計(jì)算,PEI750000-R及PI-4-R上的抗體數(shù)目分別為250和300。納米抗體與抗原的結(jié)合、解離能力檢測(cè)結(jié)果表明,與母代游離的Rituximab相比,不同類(lèi)型的納米抗體與Raji細(xì)胞表面CD20分子的結(jié)合能力相似,但是其解離率卻大大下降,說(shuō)明納米抗體構(gòu)建成功,暗示其與腫瘤細(xì)胞的相互作用更強(qiáng)。隨后,我們分別采用人血清和人外周血淋巴細(xì)胞來(lái)進(jìn)行補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用(Complement-dependent cytotoxicity,CDC)和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(Antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們所制備的六種納米抗體具有與Rituximab類(lèi)似的CDC和ADCC效應(yīng),說(shuō)明我們對(duì)抗體的改造并未改變母代抗體的結(jié)構(gòu)和功能。然而,我們利用流式細(xì)胞儀對(duì)納米抗體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡(Programmed cell death,PCD)進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn),相對(duì)于Rituximab,納米抗體獲得了很高的類(lèi)似于II型抗CD20抗體所具有的PCD功能。而且,該P(yáng)CD效應(yīng)隨著鏈長(zhǎng)的增加(也就是抗原交聯(lián)程度增加)而明顯增強(qiáng);同時(shí),在相同抗原交聯(lián)情況下,隨著溫度的升高(抗原受限程度增加),納米抗體誘導(dǎo)的PCD進(jìn)一步增加。隨后,我們通過(guò)流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡等技術(shù)對(duì)納米抗體誘導(dǎo)PCD的機(jī)制進(jìn)一步探討,結(jié)果顯示,當(dāng)進(jìn)一步增加抗原交聯(lián)或抗原受限后,納米抗體誘發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)溶酶體破裂或彌散程度增強(qiáng),釋放出溶酶體內(nèi)容物組織蛋白酶B增多;而組織蛋白酶B作用于線粒體上的相關(guān)蛋白,導(dǎo)致線粒體通透性增加,釋放出細(xì)胞色素C,進(jìn)而激活下游的Casepase凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。該溶酶體依賴性的凋亡功能在蛋白質(zhì)印跡中得到進(jìn)一步證實(shí)。之后,我們通過(guò)皮下荷瘤小鼠(SCID鼠)和原位血液^

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