本文關鍵詞：α7nAChR對多發(fā)性骨髓瘤細胞促血管生成功能的影響及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的:多發(fā)性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)是以骨髓中漿細胞惡性克隆性增殖且腫瘤細胞與骨髓微環(huán)境密切聯(lián)系來支撐MM細胞生長和增殖,為主要特征的一種惡性腫瘤。MM的發(fā)病率占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%左右,MM具有侵襲性強、易耐藥和血管生成顯著等特點,使絕大多數(shù)患者進入難治或復發(fā)階段。因此對MM的治療提出新的挑戰(zhàn),也使其成為血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究的熱點。α7尼古丁乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR),是尼古丁乙酰膽堿受體的一個亞型。α7nAChR廣泛分布于中樞和周圍神經系統(tǒng),近年來發(fā)現(xiàn)其在上皮細胞、免疫細胞以及肺癌細胞等細胞上也有表達;其生物學功能也涉及到了認知、炎癥調控、癌癥發(fā)展等多個方面。研究發(fā)現(xiàn)給予膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊可促進缺血組織中的血管新生,使用α7nAChR抑制劑MG624可以抑制肺癌中的血管新生。有文獻報道,在MM的發(fā)生發(fā)展過程中,血管生成具有十分重要的作用。2013白血病雜志也指出,骨髓瘤患者預后效果與血管生成關系密切,當患者骨髓中新生血管顯著增多時,患者一般預后較差。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的最重要的正向調控血管生成的細胞因子,在多種惡性腫瘤中高表達,如胃癌,鼻咽癌及骨髓瘤等。且研究發(fā)現(xiàn)VEGF的高表達可能與MM的血管生成及不良預后有關。源自于神經外胚層及中胚層細胞的堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)也是研究較多的促進血管生成的細胞因子之一。b FGF在多種惡性腫瘤中也存在過表達的現(xiàn)象,可與VEGF協(xié)同作用促進腫瘤的發(fā)展進程。有研究指出血小板反應素-1(Thrombospond1n-1,TSP-1)又稱為血小板反應蛋白-1,是一種內源性血管生成抑制劑,主要由血小板,內皮細胞及腫瘤細胞等分泌,可通過直接影響血管內皮細胞的增殖、凋亡和遷移以及拮抗VEGF來發(fā)揮抑制血管生成的作用。研究表明,TSP-1可作為前列腺癌,甲狀腺乳頭癌及非小細胞肺癌等腫瘤的輔助診斷指標。目前關于α7nAChR與MM尚無研究報道。因此,本課題圍繞α7nAChR是否在多發(fā)性骨髓瘤細胞促血管生成的過程中發(fā)揮作用開展研究并探討其可能的機制。研究內容及結果:選取MM細胞株U266及人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為主要的研究對象,并利用PNU-282987(α7nAChR的選擇性激動劑)和MLA(α7nAChR的選擇性拮抗劑)為主要的研究藥物,利用細胞與細胞之間通過Transwell小室間接共培養(yǎng)方式來模擬骨髓微環(huán)境,進而開展研究。1.U266細胞表達α7nAChR利用Western blot檢測U266細胞中α7nAChR蛋白表達,選取RAW264.7及HUVECs作為α7nAChR表達的陽性對照。結果提示,U266細胞也表達α7nAChR。激光共聚焦顯微鏡下檢測到U266細胞可被α7nAChR抗體(綠色熒光,主要分布在細胞膜)及DAPI(藍色熒光,主要分布在細胞核)共定位,也進一步證明U266細胞表達α7nAChR。2.不同濃度的PNU-282987對U266細胞活力的影響采用CCK8檢測不同濃度的α7nAChR激動劑PNU-282987(1,10,50μM)處理U266細胞6h后的細胞活力,發(fā)現(xiàn)50μM的PNU-282987使U266細胞活力下降;1μM和10μM的PNU-282987對U266細胞活性幾乎無影響。后續(xù)實驗中選取10μM的PNU-292987預處理U266細胞6h。3.不同濃度的MLA對U266細胞活力的影響采用CCK8檢測不同濃度α7nAChR拮抗劑MLA(100,200,300,400,500μM)處理U266細胞6h后的細胞活力,發(fā)現(xiàn)300μM,400μM及500μM的MLA使U266細胞活力下降;100μM和200μM的MLA對U266細胞活性影響不明顯。后續(xù)實驗中選取200μM的MLA預處理U266細胞6h。4.PNU-282987對HUVECs細胞活力及小管生成能力的無明顯影響選用PNU-282987(10μM)預處理細胞24h,然后測定HUVECs的細胞活力及小管生成能力。發(fā)現(xiàn),與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義。5.U266與HUVECs共培養(yǎng),測定HUVECs的小管生成能力選用PNU-282987(10μM),MLA(200μM),MLA(200μM)+PNU-282987(10μM)預處理U266細胞6h后,去掉藥物,將其與預先鋪板的HUVECs共培養(yǎng),測定共培養(yǎng)24h后的HUVECs小管生成能力。結果表明,和單獨培養(yǎng)HUVECs相比,U266細胞與HUVECs共培養(yǎng)后可提高其小管生成能力;使用PNU-282987預處理之后的U266細胞再與HUVECs共培養(yǎng),可使其促進HUVECs的小管生成能力下降;使用α7nAChR的拮抗劑MLA(200μM)+PNU-282987(10μM)預處理U266細胞后與HUVECs共培養(yǎng),能夠阻斷PNU-282987預處理U266導致的共培養(yǎng)后HUVECs小管生成能力下降的現(xiàn)象。另外使用MLA單獨或與PNU-282987聯(lián)合處理U266細胞6h后再將其與HUVECs共培養(yǎng),與U266細胞與HUVECs共培養(yǎng)后的HUVECs的小管生成能力相比,其差異并無統(tǒng)計學意義。6.PNU-282987激動U266細胞的α7nAChR會降低共培養(yǎng)后HUVECs的小管生成能力,可能與b FGF的表達水平下調有關VEGF是主要的血管生長促進因子,TSP-1是內源性的抑制血管生長因子。由前期結果可知,U266細胞與HUVECs共培養(yǎng)24h后,可提高其小管生成能力;使用PNU-282987預處理U266細胞后,促HUVECs小管生成能力卻下降。這一現(xiàn)象說明,U266細胞可能產生某些促血管生成因子或減少了抑制血管生成因子的釋放,經PNU-282987預處理后,這一作用被抑制。為了探討可能的機制,我們首先選用ELISA檢測U266細胞經PNU-282987(0,10μM)預處理6h及去掉藥物作用繼續(xù)培養(yǎng)24h后,細胞培養(yǎng)上清中的VEGF及TSP-1的含量。結果表明,PNU-282987并不影響U266細胞分泌VEGF及TSP-1的水平。然后我們選用血管生成相關細胞因子抗體芯片(同時檢測20個血管生成相關的細胞因子)對去掉PNU-282987(0,10μM)作用后繼續(xù)培養(yǎng)24h的U266細胞上清進行檢測,發(fā)現(xiàn)PNU-282987預處理后可降低U266細胞分泌b FGF的水平。結論:α7nAChR參與了U266細胞與HUVECs共培養(yǎng)的血管生成過程,PNU-282987激動U266細胞的α7nAChR會降低共培養(yǎng)后HUVECs的小管生成能力,這一現(xiàn)象可能與U266細胞分泌的促血管生長因子b FGF的表達水平下調有關。研究背景及目的:多發(fā)性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)是以骨髓中漿細胞惡性克隆性增殖并伴有單克隆免疫球蛋白分泌為主要特征的一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤。MM好發(fā)于老年人,隨著人口老齡化的加劇,MM的發(fā)病率有逐年增高的趨勢,放療與化療是治療MM的主要手段。地塞米松(dexamethasone,DEX)是糖皮質激素類衍生物,具有抗炎、抗休克、免疫抑制等藥理作用。近年來,依照《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》指導,DEX作為MM化療方案中的基礎藥物在臨床使用。氯喹(chloroquine,CQ)是治療瘧疾的經典藥物,“老藥新用”是目前氯喹研究的新方向。已有文獻報導,CQ具有抗腫瘤的作用。Tang等研究表明CQ能夠增加吉非替尼對非小細胞肺癌的細胞毒性;Han等發(fā)現(xiàn)CQ可以增加乳腺癌細胞的放射敏感性。低氧誘導因子1(hypoxia induced factor 1,HIF-1)是一種在缺氧條件下普遍存在的異源二聚體核轉錄因子,有α及β亞單位組成,其中α亞單位決定其活性。與其他腫瘤不同的是,多發(fā)性骨髓瘤細胞處于相對密閉的缺氧骨髓微環(huán)境中,因此研究HIF-1α對于進一步了解骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展過程具有十分重要的意義。B細胞淋巴瘤-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)是抗凋亡家族的一員,是細胞凋亡通路中線粒體途徑的關鍵調節(jié)分子,主要作用于線粒體外膜。染色體異位能夠誘導Bcl-2蛋白過表達,促使腫瘤的發(fā)生。故本課題針對CQ與DEX或輻射聯(lián)用后對MM細胞株U266的殺傷作用開展研究,并對其可能的機制進行初步探討。研究內容及結果:選取MM細胞株U266為研究對象,CQ及DEX為研究藥物,60Co-γ線照射為輻射方式,進而開展研究。1.CQ及DEX均濃度依賴性地抑制U266細胞的增殖配制一系列濃度的CQ(終濃度為:1000,500,250,125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9,2.0,1.0μM,2倍比稀釋)及DEX(終濃度為:2000,1000,500,250,125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9,2.0μM,2倍比稀釋),選取對數(shù)生長期的U266細胞,接種于96孔板中。藥物處理U266細胞24h后,每孔加入10ul的CCK8檢測試劑,在450nm處檢測吸光度,計算細胞的增殖率(%)及抑制率(%)。結果顯示:CQ及DEX對U266細胞的增殖抑制作用均呈濃度依賴性,且CQ對U266細胞的半數(shù)致死濃度IC50約為77.9μM,DEX對U266細胞的IC50約為237.1μM。2.CQ增強化學藥物DEX對U266細胞的增殖抑制作用選用不同濃度的CQ(終濃度為:125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9μM)與DEX(終濃度為:250,125μM)聯(lián)用,并設置了相應的單藥濃度組處理細胞。藥物作用24h后加入CCK-8試劑,檢測各孔的吸光度。利用中效原理軟件(Compusyn軟件),求出兩藥合用時的聯(lián)用指數(shù)(Combination index,CI)。結果發(fā)現(xiàn):當DEX濃度為125μM,CQ:DEX(c/c)在1:32~1:4時,CI"f1,說明兩藥協(xié)同或相加作用殺傷U266細胞;CQ:DEX(c/c)在1:2~1:1時,CI1,說明CQ與DEX聯(lián)用是拮抗作用。當DEX濃度為250μM,CQ:DEX(c/c)在1:64~1:8時,CI1,兩藥聯(lián)用后為協(xié)同作用;CQ:DEX(c/c)在1:4~1:2時,CI"g1,兩藥聯(lián)用后為拮抗或相加作用。值得一提的是,DEX單藥濃度為125μM時,對U266細胞的抑制率約為30%;CQ單藥濃度為7.8μM及3.9μM時,細胞抑制率約為8%;但當DEX與CQ聯(lián)用時,細胞抑制率分別增加到了45%及36%,且此時兩藥的CI均1,表現(xiàn)為協(xié)同殺傷作用�？紤]到高濃度的DEX與低濃度的CQ聯(lián)用時,DEX發(fā)揮主要的抑制細胞增殖作用,故我們將這一現(xiàn)象表述為CQ增強DEX對U266細胞的殺傷作用。3.不同輻射劑量對U266細胞的殺傷作用差異不明顯為了研究放療對MM細胞的殺傷作用,我們首先選取了不同的輻射劑量(5,10,15,20,5Gy)來照射U266細胞。與0Gy(對照組)相比,不同劑量的輻射使U266細胞的增殖能力下降,增殖率降為80%左右;但各組之間的差異并無統(tǒng)計學意義。4.CQ增敏輻射對U266細胞的殺傷作用細胞分組為:對照組,CQ組(1μM),輻射組(5Gy),輻射+CQ組。采用CCK-8法及流式細胞術分別檢測細胞增殖率及凋亡率。結果表明:CQ單獨給藥對U266細胞的增殖及凋亡幾乎無影響;輻射后,U266細胞增殖能力下降,凋亡比例增加;給予CQ預處理后再進行輻射,細胞的增殖率下降更明顯,凋亡程度增加地更顯著。5.CQ增強DEX對U266細胞的殺傷作用可能與Bcl-2蛋白的表達下調有關通過Western blot方法分別檢測了CQ與化學藥物DEX或輻射聯(lián)用后的細胞內的HIF-1α和Bcl-2蛋白的表達。結果提示:CQ與DEX或輻射聯(lián)用并不影響U266細胞內HIF-1α的表達;U266細胞經3.9μM的CQ處理后,Bcl-2蛋白水平無明顯變化;經125μM的DEX處理后,胞內Bcl-2的表達下降;當兩藥合用后,Bcl-2蛋白表達水平顯著下降。提示,CQ增敏DEX對U266細胞的殺傷作用可能與抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調有關。但是,CQ預處理U266細胞后再輻射,檢測Bcl-2的表達,其差異無統(tǒng)計學意義。結論:傳統(tǒng)抗瘧藥CQ能夠增強化學藥物DEX或輻射對于MM細胞U266的殺傷作用,且CQ增敏DEX殺傷U266細胞的機制可能與抑制Bcl-2蛋白的表達有關。
【關鍵詞】：α7尼古丁乙酰膽堿受體 多發(fā)性骨髓瘤細胞U266 人臍靜脈內皮細胞 血管生成 氯喹 地塞米松 輻射 多發(fā)性骨髓瘤細胞U266 增敏
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 課題一 α7nAChR對多發(fā)性骨髓瘤細胞促血管生成功能的影響及其機制研究 Role of α7nAChR in the angiogenesis induced by multiple myeloma cell5-47
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-15
• 材料和方法15-28
• 實驗結果28-38
• 討論38-42
• 結論42-43
• 參考文獻43-47
• 課題二 氯喹增敏地塞米松或輻射對多發(fā)性骨髓瘤細胞的殺傷作用 Chloroquine sensitizes cytotoxic effects of dexamethasone or radiation on multiple myeloma cells47-77
• 摘要48-51
• Abstract51-54
• 縮略詞表54-55
• 前言55-57
• 材料和方法57-60
• 實驗結果60-70
• 討論70-73
• 結論73-74
• 參考文獻74-77
• 附錄77-78
• 綜述 Targeting α7 nicotinic acetylcholine receptor to combat inflammation In cardio-cerebral-vascular diseases78-92
• References86-92
• 碩士在讀期間發(fā)表論文和參加科研情況92-93
• 致謝93

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：363380