本文關(guān)鍵詞：人血中氨基酸及肉堿定量檢測(cè)和多肽藥物的質(zhì)量控制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：遺傳性代謝病是由于基因突變導(dǎo)致體內(nèi)某種酶、運(yùn)載蛋白、膜或受體的功能發(fā)生改變，使得機(jī)體生化代謝紊亂，造成中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏，出現(xiàn)一系列臨床癥狀的一類疾病�；颊呷绻麤]有及時(shí)診斷和治療，將會(huì)損傷神經(jīng)系統(tǒng)，影響智力，引起昏迷甚至死亡。因此，開展遺傳性代謝病篩查是十分必要的。 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法篩查遺傳性代謝病能夠?qū)Χ鄠�(gè)代謝產(chǎn)物多種疾病進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快等特點(diǎn)，其假陽(yáng)性率低、高通量的特性適合臨床上大規(guī)模的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜建立人體血液中內(nèi)源性代謝物氨基酸和�；鈮A的定量檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸類代謝疾病的篩查，并研究不同年齡、地區(qū)是否對(duì)體內(nèi)氨基酸和�；鈮A的含量有影響。 本研究建立了人體血液中10種氨基酸和32種酰基肉堿類代謝物的檢測(cè)方法。用含有內(nèi)標(biāo)的甲醇試劑提取干濾紙血片中的氨基酸和酰基肉堿，經(jīng)鹽酸正丁醇衍生化以后，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。其中大部分α-氨基酸采用中性丟失的掃描模式，丟失基團(tuán)質(zhì)荷比為102.1Da；部分酰基肉堿采用母離子掃描的模式，子離子質(zhì)荷比為85Da；其他氨基酸和�；鈮A采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的掃描模式。通過(guò)Masslynx軟件計(jì)算血樣中氨基酸和�；鈮A的含量。 這個(gè)方法能夠同時(shí)篩查13種氨基酸、13種有機(jī)酸以及11種脂肪酸類代謝疾病，當(dāng)檢測(cè)到某種代謝物含量明顯超出或低于參考值范圍時(shí)，提示該人可能患有這類疾病。在篩查的205例血樣中沒有發(fā)現(xiàn)代謝異常的患者。另外，我們還利用靶標(biāo)代謝組學(xué)的方法，針對(duì)年齡和地域因素，對(duì)44種檢測(cè)代謝物指標(biāo)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)偏最小二乘判別分析找出差異代謝物，并結(jié)合T-檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同年齡人群氨基酸和�；鈮A含量不同。出生30天以上和30天內(nèi)的人群相比，體內(nèi)纈氨酸、瓜氨酸、游離肉堿含量明顯升高，而甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、亮氨酸、乙酰肉堿、鳥氨酸的含量降低，結(jié)果呈現(xiàn)年齡相關(guān)性，提示當(dāng)進(jìn)行不同年齡人群遺傳性代謝疾病篩查時(shí)應(yīng)選擇適宜的參考值范圍。對(duì)于同一年齡段的高原同非高原人群，高原人群血液中甘氨酸和丙氨酸的含量較高，精氨酸的含量則相對(duì)較低，這可能同飲食生活習(xí)慣、高原缺氧等原因有關(guān)。這將可能為高原人群氨基酸的營(yíng)養(yǎng)健康狀況評(píng)價(jià)依據(jù)。 多肽類藥物是一類重要的生物活性物質(zhì)，具有易吸收、副作用小、生物活性強(qiáng)等特點(diǎn)，是藥物研究中一個(gè)重要領(lǐng)域。由于多肽主要由氨基酸組成，相對(duì)分子量較大，容易降解，因此在質(zhì)量控制方法有與一般的化學(xué)藥物不同的方面，除了參考一般化學(xué)藥物進(jìn)行常規(guī)項(xiàng)目分析外，還應(yīng)根據(jù)多肽的特點(diǎn)進(jìn)行針對(duì)性研究。 艾塞那肽是一種人工合成的含有39個(gè)氨基酸的多肽類糖尿病治療藥物，為胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，對(duì)Ⅱ型糖尿病患者的血糖控制有良好的效果，具有促進(jìn)胰腺β細(xì)胞增殖和胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的釋放以及減緩胃排空、抑制食物攝取的作用。是近年來(lái)首個(gè)在全球范圍內(nèi)獲批的新型治療Ⅱ型糖尿病的藥物。 本研究擬通過(guò)對(duì)艾塞那肽的實(shí)驗(yàn)研究，達(dá)到對(duì)其生產(chǎn)使用過(guò)程的質(zhì)量控制。根據(jù)中國(guó)藥典和合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則，結(jié)合艾塞那肽合成工藝，參考有關(guān)文獻(xiàn)，，對(duì)艾塞那肽的質(zhì)量控制方法進(jìn)行系統(tǒng)研究。通過(guò)對(duì)艾塞那肽分析的探索，建立多肽類藥物質(zhì)量控制的相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目和方法，為多肽類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。 主要從純度、分子量、氨基酸序列、氨基酸組成、肽圖、等電點(diǎn)、紅外光譜、紫外光譜、有關(guān)物質(zhì)方面對(duì)艾塞那肽進(jìn)行質(zhì)量控制分析。利用高效液相色譜測(cè)定艾塞那肽純度為99.63%。經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜表明該化合物的相對(duì)分子量為4186.86Da，與理論計(jì)算分子量4186.60Da相比差2.6ppm。采用Edman降解和串聯(lián)質(zhì)譜的方法分別對(duì)艾塞那肽進(jìn)行N端15個(gè)氨基酸分析和全序列分析，結(jié)果均與理論序列一致，證明不存在截短肽或修飾性肽鏈以及其它多肽。氨基酸組成分析的結(jié)果表明艾塞那肽氨基酸種類及組成含量與理論值相符，各種氨基酸摩爾百分含量的偏差小于1.5%。艾塞那肽的肽質(zhì)量指紋圖譜有4個(gè)特征肽段，各肽段分子量與理論值基本相同。等電點(diǎn)測(cè)定采用凝膠等電聚焦電泳和全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳(Capillary Isoelectric Focusing-Whole Column ImagingDetection, CIEF-WCID)的方法，結(jié)果基本相同，但CIEF-WCID所需時(shí)間明顯較短。艾塞那肽的紫外和紅外光譜信息能夠表明樣品分子結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵、氨基肽鍵、酚羥基、甲基、亞甲基、苯基等基團(tuán)。 研究中首次運(yùn)用CIEF-WCID方法建立了艾塞那肽有關(guān)物質(zhì)的分析檢測(cè)方法。首先利用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)艾塞那肽合成過(guò)程中可能產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)，即斷裂肽3-39、N端乙�；腁c-His、氧化肽Met14SO和斷裂肽10-39進(jìn)行全序列分析，確證其結(jié)構(gòu)。然后考察CIEF-WCID方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，檢測(cè)三種多肽的等電點(diǎn)相對(duì)誤差不超過(guò)2%，日內(nèi)和日間精密度分別小于0.12%和0.24%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。最后使用CIEF-WCID的方法對(duì)艾塞那肽及其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了分離分析，通過(guò)加入不同濃度和不同種類的增溶劑(尿素、甘油、蔗糖)、改變兩性電解質(zhì)范圍、更換兩性電解質(zhì)品牌的方式改善艾塞那肽和有關(guān)物質(zhì)的分離度，最終確定使用AES pH3-10和Sigma pH4-6的兩性電解質(zhì)對(duì)艾塞那肽樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。該結(jié)果提示CIEF-WCID的方法可以用做對(duì)多肽的分離測(cè)定和質(zhì)量控制，為今后多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量研究提供一種新的技術(shù)手段。
【關(guān)鍵詞】：遺傳性代謝病 靶標(biāo)代謝組學(xué) 艾塞那肽 質(zhì)量控制 全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R917
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-19
• 第一部分 人血中氨基酸及肉堿定量檢測(cè)19-33
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19-20
• 1.1 試劑和材料19
• 1.2 同位素內(nèi)標(biāo)和濃度19-20
• 1.3 儀器20
• 2 實(shí)驗(yàn)方法20-23
• 2.1 樣品采集20
• 2.2 工作液的配制20-21
• 2.3 樣品前處理方法21
• 2.4 液相方法21
• 2.5 質(zhì)譜方法21-22
• 2.6 方法精密度22
• 2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析22-23
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-32
• 3.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化23-25
• 3.2 方法精密度25
• 3.3 檢測(cè)代謝疾病種類25-27
• 3.4 檢測(cè)結(jié)果27-29
• 3.5 結(jié)果分析29-32
• 4 小結(jié)32-33
• 第二部分 多肽藥物的質(zhì)量控制33-61
• 1 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 1.1 試劑和材料33-34
• 1.2 儀器34
• 2 實(shí)驗(yàn)方法34-38
• 2.1 純度34
• 2.2 分子量34
• 2.3 氨基酸序列分析34-35
• 2.4 氨基酸組成分析35
• 2.5 肽質(zhì)量指紋圖譜35-36
• 2.6 等電點(diǎn)36
• 2.7 紅外光譜36
• 2.8 紫外光譜36
• 2.9 有關(guān)物質(zhì)36-38
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-58
• 3.1 純度38-39
• 3.2 分子量39
• 3.3 氨基酸序列分析39-43
• 3.4 氨基酸組成分析43-44
• 3.5 肽質(zhì)量指紋圖譜44-45
• 3.6 等電點(diǎn)45-47
• 3.7 紅外光譜47-48
• 3.8 紫外光譜48
• 3.9 有關(guān)物質(zhì)48-58
• 4 小結(jié)58-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 綜述：串聯(lián)質(zhì)譜法在新生兒遺傳代謝病篩查中的應(yīng)用67-75
• 參考文獻(xiàn)72-75
• 論著：全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳測(cè)定艾塞那肽等電點(diǎn)75-83
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷83-84
• 致謝84

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 艾婷;劉俐;;2010年西安地區(qū)高危嬰幼兒中遺傳代謝病篩查情況分析[J];中國(guó)兒童保健雜志;2012年03期

2 顧學(xué)范;葉軍;韓連書;;上海地區(qū)遺傳代謝病的新生兒篩查(英文)[J];臨床兒科雜志;2009年02期

3 顧學(xué)范,周建德,葉軍;上海地區(qū)新生兒先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的篩查[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2002年01期

  本文關(guān)鍵詞：人血中氨基酸及肉堿定量檢測(cè)和多肽藥物的質(zhì)量控制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：358779