本文關(guān)鍵詞：三氯生通過(guò)誘導(dǎo)自噬加強(qiáng)巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)寄生菌機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自噬是真核生物進(jìn)化中高度保守的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程,其功能是降解和回收細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)和受損細(xì)胞器。自噬不僅能以非選擇性的方式降解底物,還能以選擇性的方式清除細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)。因此,選擇性自噬在對(duì)抗病原微生物的過(guò)程中扮演了重要的角色,是宿主細(xì)胞重要的免疫應(yīng)答反應(yīng)。這個(gè)既保守又復(fù)雜的過(guò)程需要完善的調(diào)控機(jī)制來(lái)支撐,已有超過(guò)36種自噬相關(guān)基因(Autophagy-related gene,ATG)在酵母細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),其表達(dá)的蛋白常常以形成復(fù)合物的形式參與自噬過(guò)程的調(diào)控,此外,越來(lái)越多的自噬通路正在被人們所發(fā)現(xiàn)。三氯生是一種廣譜抗菌劑,具有抗大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性無(wú)芽孢菌、一些真菌、瘧原蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)的作用。至今,已經(jīng)揭示的三氯生抗菌機(jī)制為“其通過(guò)抑制病原菌脂肪酸合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的脂肪酸合成酶II型(FAS II)的活性達(dá)到抗菌效果”。三氯生通過(guò)該作用機(jī)制不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性,因此被添加在多種消毒劑和洗護(hù)用品中,并且目前已有三氯生成功治療小鼠系統(tǒng)性細(xì)菌感染的研究報(bào)道�；谏鲜鋈壬咕膹V譜性和自噬在抗病原微生物中的作用,在本研究中,我們以巨噬細(xì)胞RAW264.7為模式細(xì)胞,結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn),探究三氯生能否通過(guò)誘導(dǎo)自噬加強(qiáng)巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)寄生菌,并考察其作用機(jī)制。首先,我們利用熒光顯微鏡對(duì)經(jīng)三氯生作用的He La細(xì)胞表達(dá)GFP-LC3的水平進(jìn)行觀察;利用透射電鏡對(duì)三氯生作用的RAW264.7細(xì)胞中的自噬體進(jìn)行觀察;利用western blot技術(shù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的LC3表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè);利用western blot技術(shù)對(duì)三氯生作用的小鼠肝臟、脾臟內(nèi)LC3表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè);對(duì)He La細(xì)胞GFP-LC3、RFP-LC3的表達(dá)情況進(jìn)行熒光顯微鏡觀察;對(duì)三氯生和氯喹(CQ)處理的RAW264.7細(xì)胞中LC3表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果表明:三氯生可誘導(dǎo)He La細(xì)胞中GFP-LC3斑點(diǎn)增多以及RAW264.7細(xì)胞中自噬體增加;三氯生誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞、小鼠肝臟、小鼠脾臟中LC3-II/LC3-I的值增加;三氯生誘導(dǎo)He La細(xì)胞中GFP-LC3、RFP-LC3斑點(diǎn)增多,且后者多于前者;三氯生作用過(guò)程中的LC3降解過(guò)程能被CQ抑制。其次,我們利用western blot技術(shù)分別檢測(cè)了不同濃度三氯生作用不同時(shí)間的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)m TOR、p70S6K、4E-BP1、AMPK-α、AMPK-β、ULK1、ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化水平;利用western blot技術(shù)分別檢測(cè)抑制劑PD98059、SB203580、SP600125預(yù)處理三氯生作用細(xì)胞的ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化水平以及LC3的表達(dá)水平。結(jié)果表明:三氯生不能抑制m TOR、p70S6K、4E-BP1的磷酸化;三氯生能誘導(dǎo)AMPK-α、AMPK-β、ULK1、ERK、JNK、p38的磷酸化;SP600125可抑制三氯生誘導(dǎo)的ERK、JNK、p38的磷酸化,SB203580可抑制三氯生誘導(dǎo)的ERK、p38的磷酸化,PD98059可抑制三氯生誘導(dǎo)的ERK的磷酸化。最后,我們利用激光共聚焦顯微鏡觀察沙門氏菌、白色念珠菌及其分別加入三氯生之后作用于RAW264.7細(xì)胞的p62、NDP52、LC3蛋白的表達(dá)水平和共定位水平;利用菌落計(jì)數(shù)對(duì)三氯生是否體外能加強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞吞噬、殺傷能力進(jìn)行評(píng)價(jià);利用菌落計(jì)數(shù)對(duì)三氯生是否能體內(nèi)加強(qiáng)小鼠沙門氏菌感染模型和白色念珠菌感染模型中殺菌能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:三氯生能誘導(dǎo)p62、NDP52的表達(dá)以及能加強(qiáng)p62、NDP52與菌的共定位;三氯生體外能夠加強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞對(duì)沙門氏菌、白色念珠菌的吞噬和清除;三氯生體內(nèi)能夠加強(qiáng)小鼠沙門氏菌感染模型和白色念珠菌感染模型中對(duì)病原菌的清除�？傊�,本研究結(jié)果表明,三氯生能通過(guò)激活A(yù)MPK/ULK1和JNK/ERK/p38途徑的磷酸化而非抑制m TOR途徑的磷酸化誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,并且通過(guò)這一作用機(jī)制加強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)菌的清除。本研究豐富了三氯生的抗菌機(jī)制,為以三氯生為先導(dǎo)化合物的抗系統(tǒng)性細(xì)菌感染藥物開(kāi)發(fā)及以自噬為藥靶的抗菌新藥發(fā)現(xiàn)打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：三氯生 巨噬細(xì)胞 自噬 殺菌 機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮寫(xiě)詞表11-12
• 引言12-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-31
• 第一章 三氯生的藥理作用及應(yīng)用研究進(jìn)展13-18
• 1.1 三氯生概述13-14
• 1.2 三氯生的抗菌機(jī)制14-16
• 1.3 三氯生的應(yīng)用16-18
• 第二章 細(xì)胞自噬研究進(jìn)展18-29
• 2.1 概述18
• 2.2 自噬的分類18-21
• 2.3 自噬的發(fā)生過(guò)程21-22
• 2.4 自噬的通路及調(diào)控22-26
• 2.5 自噬的生物學(xué)作用26-29
• 第三章 巨噬細(xì)胞研究進(jìn)展29-31
• 3.1 巨噬細(xì)胞概述29
• 3.2 巨噬細(xì)胞抗菌機(jī)制29-31
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容31-65
• 第一章 三氯生誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬31-46
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料31-33
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法33-38
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-43
• 1.4 討論43-45
• 1.5 小結(jié)45-46
• 第二章 三氯生誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的機(jī)制研究46-54
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法47
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-51
• 2.4 討論51-53
• 2.5 小結(jié)53-54
• 第三章 三氯生通過(guò)誘導(dǎo)自噬加強(qiáng)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)菌清除54-65
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料54-55
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法55-58
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-63
• 3.4 討論63-64
• 3.5 小結(jié)64-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-75
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介75-76
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果76-77
• 致謝77

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本文編號(hào)：319186