本文關鍵詞：EphB4受體對人胚胎神經(jīng)干細胞增殖、分化的影響機理及藥物莫諾苷的干預作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：缺血性腦卒中損傷后期的神經(jīng)再生修復是腦卒中康復治療的關鍵。目前干細胞治療是國際神經(jīng)科學研究的熱點和重點,腦卒中能刺激內源性神經(jīng)干細胞的增殖短時間內躍遷,其潛在的機制受多條信號通路調控�；谏窠�(jīng)血管單元的概念,本課題組2007年提出腦卒中等疾病治療的“神經(jīng)血管穩(wěn)態(tài)重構”假說,希望通過給予外源性的藥物或手段調節(jié)特異性的分子機制,增強腦損傷誘導的自體干細胞增殖及分化過程,最終促進神經(jīng)血管穩(wěn)態(tài)的重構。課題組前期研究提示,受體酪氨酸激酶Eph/ephrin信號通路可能參與了中藥山茱萸的有效成份莫諾苷(morroniside)促神經(jīng)發(fā)生的作用機制,該激酶家族的多個成員在細胞增殖和血管生成中有重要作用。本研究的目的是從分子水平探討EphB4受體對人胚胎神經(jīng)干細胞(human embryonic neural stem cells,NSCs)增殖、分化的影響機理,同時觀察藥物莫諾苷對體外培養(yǎng)的人胚胎神經(jīng)干細胞增殖、分化的影響,探討其通過增強神經(jīng)發(fā)生治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能機制。研究采用體外培養(yǎng)的NSCs,分別在3天進行巢蛋白(nestin)免疫熒光染色,10天進行神經(jīng)元(β-Ⅲtublin)、星形膠質細胞(GFAP)免疫熒光染色,16天進行少突膠質細胞(Galc)免疫熒光染色,激光共聚焦掃描圖片進行NSCs鑒定。針對人EphB4基因構建3組短發(fā)卡RNA(sh RNA)慢病毒載體(攜帶綠色熒光蛋白(GFP)),對培養(yǎng)的NSC進行轉染,采用實時熒光定量qRT-PCR(Real time quantitative PCR)和免疫蛋白印跡(Western blot)檢測并篩選出干擾效果最好的shRNA慢病毒載體EPHB4-RNAi(28947-1)-1 sh RNA序列。同時,構建1組過表達人EphB4基因(overexpression,OE)慢病毒載體。分別采用qRT-PCR和Western blot兩種方法檢測轉染效率。采用Ki67免疫熒光染色檢測NSCs的增殖,nestin、β-Ⅲtublin、GFAP免疫熒光染色檢測NSCs的分化,Hoechest33342/PI雙染色法檢測NSCs的凋亡。研究結果顯示:(1)NSCs轉染LV-sh RNA-EphB4后,EphB4mRNA和蛋白表達都顯著減少(p0.001,p0.001);NSCs轉染LVOE-Eph B4后,EphB4 mRNA和蛋白表達都顯著增加(p0.05,p0.05),表明EphB4-shRNA和過表達慢病毒轉染NSCs成功。(2)與其對照組相比,EphB4-sh RNA組Ki67+/GFP+、nestin+/GFP+、β-Ⅲtublin+/GFP+細胞均顯著減少(p0.001,p0.001,p0.001),GFAP+/GFP+細胞顯著增加(p0.001),細胞凋亡率顯著增加(p0.05);與其對照組相比,Eph B4-OE組Ki67+/GFP+、nestin+/GFP+、β-Ⅲtublin+/GFP+細胞顯著增加(p0.001,p0.01,p0.01),GFAP+/GFP+細胞顯著減少(p0.001),細胞凋亡率顯著減少(p0.01)。(3)轉染LVshRNA-EphB4后給予藥物莫諾苷(100μmol·L-1)作用48h,與單純干擾組相比,Ki67+/GFP+、nestin+/GFP+、β-Ⅲtublin+/GFP+細胞顯著增加(p0.001,p0.05,p0.001),細胞凋亡率顯著減少(p0.05)。由此得出結論:EphB4基因的表達可以促進體外培養(yǎng)NSCs的增殖及神經(jīng)元分化,降低細胞凋亡率,提示EphB4受體在神經(jīng)干細胞增殖、分化中起到重要的作用;藥物莫諾苷能顯著促進NSCs的增殖以及向神經(jīng)元方向的分化,且該作用機制不局限于EphB4信號通路。
【關鍵詞】：人胚胎神經(jīng)干細胞 Eph B4 短發(fā)卡RNA 過表達 莫諾苷 增殖 分化
【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-14
• 材料與方法14-26
• 結果26-30
• 附圖30-53
• 附表53-57
• 討論57-61
• 參考文獻61-67
• 結論67-68
• 綜述 EphB/EphrinB信號通路對中樞神經(jīng)功能的研究進展68-78
• 參考文獻74-78
• 致謝78-79
• 個人簡歷79

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  本文關鍵詞：EphB4受體對人胚胎神經(jīng)干細胞增殖、分化的影響機理及藥物莫諾苷的干預作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：314475