本文關(guān)鍵詞：具有GPx4和ApSOD活性的雙功能酶的原核表達(dá)及活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：機(jī)體生理代謝過程中會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),不同濃度的活性氧會對機(jī)體產(chǎn)生有害或有利的影響。低濃度的活性氧可以參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、刺激細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)凋亡等。在某些病理?xiàng)l件下機(jī)體會產(chǎn)生大量的活性氧,過量的活性氧會對機(jī)體造成嚴(yán)重的影響,如破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA等。生物體內(nèi)存在著一種重要的氧化-抗氧化平衡系統(tǒng),它是由谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)三類抗氧化酶組成,其作用就是清除機(jī)體內(nèi)多余的ROS以及修復(fù)被ROS損傷的的生物大分子,最終使得ROS維持在一個(gè)正常的生理水平。生物體內(nèi)的抗氧化過程極為復(fù)雜多變,各種抗氧化酶之間的協(xié)同作用顯得極為重要。對于單一功能的抗氧化酶的研究已經(jīng)不能夠滿足人們對抗氧化酶之間的協(xié)同作用的了解,因此開展對于具有協(xié)同作用多功能抗氧化酶的研究勢在必行。為了制備具有協(xié)同作用的GPx4_(mut)和Ap SOD活性的雙功能酶,我們選取了一段柔性肽linker(GGGGS),將GPx4_(mut)和Ap SOD基因連接在一起克隆到p Cold I表達(dá)載體上,利用缺陷原核表達(dá)系統(tǒng)直接制備出重組含GPx4_(mut)-linker-Ap SOD蛋白。GPx4_(mut)基因是由本課題組于揚(yáng)博士利用快速定點(diǎn)突變將天然GPx4所有中的Cys突變?yōu)镾er(Cys2/10/37/66/75/107/148Ser)。(1)雙功能酶編碼基因的設(shè)計(jì)我們將GPx4_(mut)基因和Ap SOD基因序列通過一個(gè)柔性肽linker(GGGGS)的基因序列連接在一起,獲得在大腸桿菌中能夠融合GPx4_(mut)和Ap SOD的編碼基因序列。(2)p Cold I-Ap SOD表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建首先將生工生物工程(上海)股份有限公司合成的克隆到p UC57載體上的Ap SOD基因使用限制性核酸內(nèi)切酶Ecol RI/Xbal酶切,膠回收獲得Ap SOD(Ecol RI/Xbal),同時(shí)將p Cold I載體同樣使用限制性核酸內(nèi)切酶Ecol RI/Xbal酶切,膠回收,將Ap SOD(Ecol RI/Xbal)與p Cold I(Ecol RI/Xbal)連接,最終獲得p Cold I-Ap SOD表達(dá)載體。(3)p Cold I-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建我們以p Cold I-GPx4_(mut)為模板,通過設(shè)計(jì)下游引物,利用PCR技術(shù)將linker(GGGGS)編碼基因連接到GPx4_(mut)的3’端,膠回收后獲得GPx4_(mut)-linker目的基因。使用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I/Bam HI將GPx4_(mut)-linker目的基因和p Cold I-Ap SOD進(jìn)行雙酶切,最終將二者連接在一起構(gòu)建出p Cold I-GPx4_(mut)linker-Ap SOD表達(dá)質(zhì)粒。(4)目的蛋白的表達(dá)及純化將p Cold I-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)cys半胱氨酸缺陷型大腸桿菌菌株中,獲得含有p Cold I-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD質(zhì)粒的缺陷表達(dá)菌株BL21(DE3)cys-p Cold I-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD。將p Mza F質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至該缺陷表達(dá)菌中,在15℃低溫培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)表達(dá)過夜,利用Ni~(2+)螯合層析純化目的蛋白,最終獲得Se-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD蛋白。(5)Se-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD的GPx和SOD活力的測定活力測定結(jié)果顯示,Se-Cu/Zn-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD的SOD活力86.2U/mg,Nonseleno-Cu/Zn-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD的SOD活力135.8U/mg,Nonseleno-Cu/Zn-Ap SOD的SOD活力454.8U/mg。Se-GPx4_(mut)-linker-Ap SOD的GPx活力為6.1 U/mg,低于Se-GPx4_(mut)(21.5U/mg)的活力,但仍高于小分子模擬物Ebselen。綜上所述,我們利用基因工程方法成功制備出具有GPx和SOD活性的雙功能酶,這種雙攻酶不僅對闡明酶的相互協(xié)作作用有著重要的意義,而且具有潛在的藥用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：谷胱甘肽過氧化物酶 超氧化物歧化酶 雙功能酶 半胱氨酸缺陷型表達(dá)系統(tǒng) SPP低溫表達(dá)系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮寫詞表11-13
• 第一章 緒論13-25
• 1.1 谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）14-19
• 1.1.1 GPx分類15-16
• 1.1.2 GPx結(jié)構(gòu)16-17
• 1.1.3 GPx催化機(jī)制17-19
• 1.1.3.1 乒乓機(jī)制17-18
• 1.1.3.2 順序機(jī)制18-19
• 1.2 超氧化物歧化酶（SOD）19-23
• 1.2.1 SOD種類與分布19-20
• 1.2.2 SOD的結(jié)構(gòu)20-21
• 1.2.3 SOD的理化性質(zhì)21-22
• 1.2.3.1 SOD對氰化物和H_2O_2敏感21-22
• 1.2.3.2 SOD的吸收光譜特性22
• 1.2.3.3 SOD是親水性的蛋白質(zhì)22
• 1.2.4 SOD的催化機(jī)理22-23
• 1.3 具有GPx和ApSOD活性的雙功能抗氧化酶23
• 1.4 立論依據(jù)23-25
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法25-36
• 2.1 序言25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料26-29
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑26-27
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器27
• 2.2.3 菌株與質(zhì)粒27
• 2.2.4 溶液配制27-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法29-36
• 2.3.1 pCold I -ApSOD質(zhì)粒的構(gòu)建29-30
• 2.3.2 CaCl_2法制備感受態(tài)細(xì)菌30
• 2.3.3 重組質(zhì)粒的篩選30
• 2.3.4 PCR擴(kuò)增GPx4_(mut)-linker目的片段30-31
• 2.3.5 pCold I-GPx4_(mut)-linker-ApSOD質(zhì)粒的構(gòu)建31-32
• 2.3.6 pCold I-GPx4_(mut)-linker-ApSOD重組質(zhì)粒的篩選32
• 2.3.7 表達(dá)菌株的構(gòu)建32
• 2.3.8 普通蛋白的表達(dá)32
• 2.3.9 缺陷表達(dá)菌株的構(gòu)建32-33
• 2.3.10 含硒蛋白的表達(dá)33
• 2.3.11 Ni~(2+)螯合層析純化目的蛋白33-34
• 2.3.12 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western Blot分析34
• 2.3.13 蛋白含量的測定34
• 2.3.14 GPx4活力測定34
• 2.3.15 Cu~(2+)、Zn~(2+)引入34
• 2.3.16 ApSOD活力的測定34-36
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-41
• 3.1 pCold I- ApSOD質(zhì)粒的構(gòu)建36
• 3.2 PCR擴(kuò)增GPx4_(mut)-linker目的片段36-37
• 3.3 pCold I-GPx4_(mut)-linker-ApSOD質(zhì)粒的構(gòu)建37-38
• 3.4 普通蛋白表達(dá)38
• 3.5 含硒蛋白的表達(dá)及純化38-40
• 3.6 Se-GPx4_(mut)-linker-ApSOD和Se-GPx4_(mut)的GPx活力測定40
• 3.7 Se- GPx4_(mut)-linker-ApSOD和Nonseleno-ApSOD的SOD活力的測定40-41
• 第四章 討論41-43
• 第五章 總結(jié)43-44
• 攻讀碩士期間取得的成績44-45
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 致謝51

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本文編號：309487