本文關(guān)鍵詞：一類新藥HZZ112的代謝、酶誘導(dǎo)抑制和蛋白結(jié)合研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：HZZ112是治療肺癌的化藥1.1類候選新藥,其一級(jí)活性代謝物HZZ1018能夠抑制角質(zhì)細(xì)胞增生,并能進(jìn)一步代謝生成二級(jí)代謝產(chǎn)物HZZ1005。本文對(duì)其臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究,主要考察了其生物轉(zhuǎn)化和血漿蛋白結(jié)合情況,比較了不同物種間代謝動(dòng)力學(xué)行為,探究了HZZ112及其活性代謝物HZZ1018和HZZ1005對(duì)主要的CYPs的抑制和誘導(dǎo)作用,并對(duì)介導(dǎo)HZZ112和HZZ1018代謝的酶系做了初步驗(yàn)證,為HZZ112進(jìn)一步開展臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究,藥效學(xué)和毒理學(xué)研究動(dòng)物模型的選取等提供參考信息。1 HZZ112活性代謝物分析目的 考察HZZ112在大鼠體內(nèi)是否產(chǎn)生活性代謝物HZZ1018和HZZ1005,以及通過體外實(shí)驗(yàn)分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)。方法收集大鼠灌胃給予HZZ112后的血漿和尿液,采用HPLC-Q-TOF/MS方法獲得HZZ112在大鼠血漿和尿液中的代謝物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖；通過體外比格犬血細(xì)胞孵育HZZ112和人肝微粒孵育HZZ1018等試驗(yàn),進(jìn)行代謝物分析。結(jié)果 給藥后,大鼠血漿和尿液中均能檢測(cè)到HZZ1018和HZZ1005分子離子峰,并且其質(zhì)譜二級(jí)碎裂圖符合兩種化合物的碎裂規(guī)律。在體外實(shí)驗(yàn)中,HZZ112在比格犬血細(xì)胞中生成活性代謝物HZZ1018,而HZZ1018在人肝微粒體中經(jīng)羰基還原生成HZZ1005,未發(fā)現(xiàn)α,β-不飽和醛酮C=C雙鍵還原產(chǎn)物。結(jié)論 通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明,HZZ112的活性代謝物主要為HZZ1018和HZZ1005。HZZ1018在人肝微粒體中主要發(fā)生羰基還原生成HZZ1005,沒有檢測(cè)到C=C雙鍵還原產(chǎn)物HZZ1018*(HZZ1018的二氫呋喃態(tài))。2 HZZ1018在不同物種肝微粒體及肝胞漿中的代謝動(dòng)力學(xué)目的 比較HZZ1018在小鼠、大鼠、犬、豬和人不同物種肝微粒體及肝胞漿中代謝生成HZZ1005的代謝動(dòng)力學(xué)行為的差異。方法 建立靈敏、簡(jiǎn)便的肝微粒體中測(cè)定HZZ1005的HPLC方法；對(duì)HZZ1018體外孵育實(shí)驗(yàn)的酶濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化；以不同底物濃度下產(chǎn)物生成速率繪制酶動(dòng)力學(xué)曲線,采用米氏方程擬合酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 建立了HPLC方法用于測(cè)定孵育體系中的還原產(chǎn)物HZZ1005,并且優(yōu)化了HZZ1018的體外孵育時(shí)間和酶濃度。為了保證底物HZZ1018的消耗量不大于20%,并避免蛋白質(zhì)的非特異性吸附,同時(shí)滿足HPLC檢測(cè)的靈敏度,最終確定HZZ1018在體外孵育系統(tǒng)中的條件：蛋白濃度為0.4 mg/mL,孵育時(shí)間為40 min。HZZ1018轉(zhuǎn)化為HZZ1005的代謝動(dòng)力學(xué)均符合經(jīng)典米氏方程。通過比較包括Km,Vmax和Clint在內(nèi)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),小型豬肝微粒體中的代謝與人肝微粒體中的代謝最為相似,其他物種均有很大不同；而在胞漿中的代謝,不同物種間差異很小。另外,值得注意的是,胞漿中代謝的清除率數(shù)值是肝微粒體中的一百多倍,這提示我們HZZ1018的代謝的主要發(fā)生在胞漿中。結(jié)論小型豬肝微粒體的代謝與人較為相似,不同物種間的胞漿代謝差異很小。HZZ1018在胞漿中的清除率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在微粒體中的清除率。3 參與HZZ112和HZZ1018代謝的酶研究目的 篩查介導(dǎo)HZZ112酯鏈斷裂和HZZ1018羰基還原的酶系。方法 1)通過加入CYPs的特異性抑制劑和利用FMOs的高溫失活的特性,考察HZZ112和HZZ1018是否由CYPs和FMOs代謝,并確定是否依賴于NADP-NADPHo 2)用相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)考察HZZ1018的代謝與主要的CYPs亞族是否有關(guān)。3)采用雙香豆素、華法林與HZZ1018在胞漿中共孵育方法,觀察HZZ1018的雙鍵是否能被還原。4)通過一系列體外孵育實(shí)驗(yàn)和重組酶實(shí)驗(yàn),考察HZZ112的代謝與乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、對(duì)氧磷酶的關(guān)系。結(jié)果1)HZZ1018的代謝與FMOs無關(guān),與CYPs有關(guān),但CYPs不是主要的代謝酶,并且HZZ1018的代謝依賴于NADP-NADPH(輔酶)的參與;HZZ112在肝微粒體和肝胞漿中均無代謝。2)相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HZZ1018的代謝與幾種CYP亞型探針底物代謝活性的相關(guān)性較差,提示它們都不是HZZ1018代謝為HZZ1005的主要代謝酶。3)香豆素類藥物對(duì)HZZ1018的代謝沒有顯著性抑制作用。4)HZZ112在比格犬血漿中(高表達(dá)乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶和對(duì)氧磷酶)和大鼠肝微粒體(高表達(dá)羧酸酯酶)中末發(fā)生明顯代謝。5)重組酯酶rhCE1、 hCE2、rhPON1和BChE對(duì)HZZ112無代謝。6)HZZ112在血漿中無代謝,在血細(xì)胞中有代謝。結(jié)論1)HZZ112在各不同物種的肝微粒體及肝胞漿中均無代謝,但其在全血中有代謝,代謝物HZZ1018主要在血細(xì)胞中生成。HZZ1018在胞漿中的代謝速率要遠(yuǎn)大于其在微粒體中的代謝,其代謝與CYPs有關(guān),但CYPs并不是其最主要的代謝酶。2)HZZ112的代謝很可能與血細(xì)胞中的特異性酯酶有關(guān),而HZZ1018的代謝則可能與胞漿中AKR1C家族有關(guān)。4 HZZ112及其代謝物對(duì)主要CYPs的抑制作用目的 通過檢測(cè)HZZ112及其代謝物對(duì)主要CYPs的抑制作用,考察HZZ112潛在的藥物-藥物相互作用。方法 采用雞尾酒法,在人肝微粒體孵育體系中,將HZZ112或其代謝物與多種CYP酶探針底物共孵育,通過探針底物的代謝速率變化評(píng)價(jià)待測(cè)物對(duì)主要藥物代謝酶活性的影響。研究了HZZ112及其代謝物對(duì)細(xì)胞色素P450同工酶CYP1A2、 2B6、2C8、2C9、2C19、2D6和3A4/5的抑制作用。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)建立了快速靈敏的HPLC-MS/MS方法同時(shí)檢測(cè)微粒體孵育液中CYP酶探針底物的代謝物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),HZZ112對(duì)CYP1A2,2B6,2C8,2C9,2C19,2D6和3A4/5都沒有明顯的抑制作用,IC50100μmol/L(50 μg/mL);而HZZ1018和HZZ1005對(duì)CYP1A2,2B6,2C8,2C9,2C19,2D6和3A4/5都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用。結(jié)論HZZ112對(duì)CYP1A2,2B6,2C8,2C9,2C19,2D6和3A4/5無明顯抑制作用,而其代謝物HZZ1018和HZZ1005對(duì)它們都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用。5 HZZ112及其代謝物對(duì)CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6的誘導(dǎo)作用目的考察HZZ112及其代謝物對(duì)CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6有無誘導(dǎo)作用。方法 本文首先通過雙熒光素酶報(bào)告基因法研究HZZ112、HZZ1018和HZZ1005對(duì)CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6的可能誘導(dǎo)作用,然后采用real-time PCR法考察它們對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2中CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6mRNA表達(dá)的影響以及小鼠經(jīng)多次給藥后肝組織中三種酶同工酶mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果 雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果顯示,除了HZZ112高劑量組有弱的通過激活人芳烴受體(hAhR)誘導(dǎo)CYP1A2的作用外,其他藥物均不表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用。real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在HepG2細(xì)胞中,高劑量的HZZ112會(huì)誘導(dǎo)CYP1A2 mRNA表達(dá)水平增加,高劑量的HZZ1018弱誘導(dǎo)CYP2B6,高劑量的HZZ1005弱誘導(dǎo)CYP3A4;給藥HZZ112的小鼠肝組織中的CYP1A2 mRNA水平也有增高,CYP3A11和CYP2B10基因的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有改變。結(jié)論HZZ1018和HZZ1005對(duì)CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6沒有誘導(dǎo)作用。高劑量的HZZ112對(duì)CYP1A2的mRNA表達(dá)有較弱的誘導(dǎo)作用,對(duì)CYP3A4和CYP2B6沒有誘導(dǎo)作用。6 HZZ112和HZZ1018的血漿蛋白結(jié)合目的考察HZZ112和HZZ1018與人、犬、大鼠血漿的蛋白結(jié)合情況。方法 采用超速離心法考察三種藥物的蛋白結(jié)合率。人、大鼠和犬血漿中HZZ112或HZZ1018的濃度分別為2,20和200μmol/L,在4℃下,以500,000 g離心17h,撥開上層脂蛋白取中層澄清液體,處理后檢測(cè)即得游離藥物濃度,進(jìn)而計(jì)算得出HZZ112和HZZ1018的血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)論HZZ112和HZZ1018在人、犬、大鼠血漿中均有很高的蛋白結(jié)合率(大于95%)。
【關(guān)鍵詞】：藥物代謝 誘導(dǎo) 抑制 藥物相互作用 血漿蛋白結(jié)合
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-10
• Abstract10-15
• 縮略詞15-20
• 1 前言20-24
• 1.1 臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)20
• 1.2 藥物的生物轉(zhuǎn)化20-21
• 1.3 藥物相互作用21-22
• 1.4 藥物的血漿蛋白結(jié)合22
• 1.5 研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)方案22-24
• 2 HZZ112活性代謝產(chǎn)物鑒定24-37
• 2.1 引言24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料24-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-36
• 2.5 小結(jié)與討論36
• 2.6 結(jié)論36-37
• 3 HZZ112和HZZ1018不同物種的代謝輪廓比較37-49
• 3.1 引言37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料37-40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法40-43
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-48
• 3.5 小結(jié)與討論48
• 3.6 結(jié)論48-49
• 4 介導(dǎo)HZZ112和HZZ1018生物轉(zhuǎn)化的酶系研究49-62
• 4.1 引言49
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料49-50
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法50-55
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-60
• 4.5 小結(jié)與討論60-61
• 4.6 結(jié)論61-62
• 5 HZZ112及其活性代謝物對(duì)CYPs的抑制作用62-71
• 5.1 引言62
• 5.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料62-63
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法63-65
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果65-70
• 5.5 討論70
• 5.6 結(jié)論70-71
• 6 HZZ112及其活性代謝物對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用71-87
• 6.1 引言71
• 6.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料71-73
• 6.3 實(shí)驗(yàn)方法73-78
• 6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果78-85
• 6.5 小結(jié)與討論85-86
• 6.6 結(jié)論86-87
• 7 HZZ112和HZZ1018在血漿中的蛋白結(jié)合情況87-95
• 7.1 引言87
• 7.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料87-88
• 7.3 實(shí)驗(yàn)方法88-90
• 7.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果90-94
• 7.5 小結(jié)與討論94
• 7.6 結(jié)論94-95
• 本研究的總結(jié)95-96
• 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)96-97
• 參考文獻(xiàn)97-100
• 綜述100-113
• 參考文獻(xiàn)110-113
• 作者簡(jiǎn)歷113

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張景園,施善平;乙酰膽堿酯酶的別構(gòu)作用——某些膽堿能效應(yīng)劑與鈣離子激活作用的關(guān)系[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1982年05期

  本文關(guān)鍵詞：一類新藥HZZ112的代謝、酶誘導(dǎo)抑制和蛋白結(jié)合研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：304874