本文關鍵詞：合成達瑪烯二醇釀酒酵母底盤細胞性能優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：植物萜類天然化合物在人們的生活中有著重要的作用,其中三萜化合物人參皂苷就具有很強的藥用價值,具有抗炎、抗腫瘤活性。達瑪烯二醇是一種人參皂苷的合成前體物,該前體物的積累有利于促進人參皂苷的生物合成。本文對達瑪烯二醇合成酶(DS)蛋白活性進行了研究,并且將優(yōu)化的外源基因DS導入釀酒酵母底盤中,調整優(yōu)化了生產(chǎn)達瑪烯二醇的代謝途徑,提高了達瑪烯二醇的產(chǎn)量。首先,根據(jù)TMHMM和TMPRED確定了DS序列中的跨膜區(qū)域,為得到游離DS蛋白以及研究跨膜區(qū)后PFTB重復序列對酶活性的影響,構建了表達截短DS的酵母菌株W303tDS0和W303tDS4�；诂F(xiàn)已知的9個達瑪烯醇合成酶蛋白序列比對,發(fā)現(xiàn)了29個氨基酸差異位點。為研究差異位點對DS活性的影響,本文對篩選的4個序列差異位點進行突變,構建了突變DS表達菌株W303DSΔa、W303DSΔ29、W303DSΔ252以及W303DSΔ624。截短和突變DS的菌株達瑪烯二醇產(chǎn)量出現(xiàn)不同程度的降低,說明截短和突變的位點對DS活性有影響,可能是DS蛋白潛在活性位點。其次,基于I-TASSER和MODELLER對DS蛋白進行同源建模,并對蛋白模型去Clash優(yōu)化得到最終的DS模型。模型顯示DS蛋白包含兩個α桶狀結構區(qū)域,它們之間通過環(huán)狀結構和3個較小的β結構連接在一起。蛋白活性位點的空腔結構處于兩個大型結構域中間,即整個蛋白分子的中心區(qū)域�；诘玫降腄S蛋白三維結構,確定DS蛋白的活性催化位點為N端第488位的天冬氨酸Asp,它負責環(huán)化反應的第一步,給2,3-氧化鯊烯的環(huán)氧部分提供質子。Asp488由它三維空間結構臨近的第489位和第568位的兩個半胱氨酸Cys激活。Asp488,Cys489和Cys568這三個氨基酸在氧化鯊烯環(huán)化酶中展現(xiàn)出很強的保守性。此外,Trp421,Phe477,Trp538,Trp616,Tyr263,Tyr732起到穩(wěn)定2,3-氧化鯊烯成環(huán)過程中底物折疊的作用。Cys264,Tyr268,Ile559是與底物進入催化活性位點的通道有關的活性位點。構建了達瑪烯二醇合成酶基因DS的優(yōu)化表達模塊,與ERG1過表達模塊一起整合到本實驗室已有的釀酒酵母底盤W303TE的基因組rDNA位點上,得到產(chǎn)達瑪烯二醇酵母工程菌WDS,達瑪烯二醇產(chǎn)量為77.05 mg/L,且與W303TE相比達瑪烯二醇前體物鯊烯的積累量減少了一半。在WDS基礎上對MVA途徑tHMGR、upc2.1、ERG1和ERG9過表達,通過多拷貝整合和強啟動子表達強化了達瑪烯二醇生產(chǎn)途徑的前體供應,篩選得到達瑪烯二醇酵母工程菌WDS-TU19。該菌株生長速率和發(fā)酵穩(wěn)定期總菌體量優(yōu)于W303TE和WDS,與底盤菌相比提前6小時到達穩(wěn)定期,達瑪烯二醇搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達到211.52 mg/L,與WDS相比提高到了2.7倍,同時解決了鯊烯在胞內的積累問題,胞內鯊烯含量僅為0.365 mgL。
【關鍵詞】：達瑪烯二醇 釀酒酵母 人參皂苷 同源建模
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R914.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 文獻綜述10-25
• 1.1 萜類化合物的生物合成10-19
• 1.1.1 萜類化合物概述10-13
• 1.1.2 萜類合物分類及其生物合成的研究13-16
• 1.1.3 人參皂苷的生物合成16-19
• 1.2 釀酒酵母平臺的合成生物學研究19-23
• 1.2.1 釀酒酵母作為底盤的平臺優(yōu)勢與挑戰(zhàn)19-20
• 1.2.2 酵母MVA途徑相關基因的研究20-22
• 1.2.3 釀酒酵母平臺中合成生物學應用22-23
• 1.3 本文研究內容及思路23-25
• 第二章 材料與方法25-35
• 2.1 實驗菌株和質粒25-26
• 2.1.1 質粒25
• 2.1.2 菌株25-26
• 2.2 藥品與試劑26-30
• 2.2.1 工具酶與藥品26-28
• 2.2.2 實驗試劑的配置28-29
• 2.2.3 培養(yǎng)基的配置29-30
• 2.3 實驗儀器30
• 2.4 實驗方法30-35
• 2.4.1 質粒構建30-32
• 2.4.2 酵母轉化32-34
• 2.4.3 酵母發(fā)酵與產(chǎn)物提取34-35
• 第三章 達瑪烯二醇合成模塊的構建及DS活性的研究35-59
• 3.1 前言35-36
• 3.2 外源達瑪烯二醇合成基因DS的優(yōu)化36-37
• 3.3 外源優(yōu)化DS模塊的構建37-38
• 3.4 截短DS模塊的構建38-42
• 3.4.1 DS跨膜結構域的分析38-40
• 3.4.2 截短tDS0和tDS4表達模塊的構建40-42
• 3.5 不同來源DS蛋白序列的比對與定點突變42-46
• 3.5.1 現(xiàn)有DS序列比對與突變位點的選擇42-43
• 3.5.2 DS模塊的定點突變43-46
• 3.6 DS蛋白同源建模與活性位點預測46-55
• 3.6.1 DS蛋白模型的構建47-50
• 3.6.2 DS蛋白模型去Clash優(yōu)化50-52
• 3.6.3 DS模型的評價與活性位點的預測52-55
• 3.7 不同DS達瑪烯二醇產(chǎn)量的對比55-58
• 3.8 本章小結58-59
• 第四章 釀酒酵母生產(chǎn)達瑪烯二醇途徑的優(yōu)化59-66
• 4.1 前言59
• 4.2 基因的提取59-61
• 4.3 MVA途徑相關基因的模塊構建61-63
• 4.4 酵母自組裝構建底盤優(yōu)化菌株63-65
• 4.5 本章小結65-66
• 第五章 產(chǎn)達瑪烯二醇酵母工程菌的構建與發(fā)酵66-74
• 5.1 前言66
• 5.2 達瑪烯二醇釀酒酵母工程菌的構建66-68
• 5.3 酵母工程菌生長曲線的測繪68-70
• 5.4 發(fā)酵產(chǎn)物的定性分析70-71
• 5.5 發(fā)酵產(chǎn)物的定量分析71-72
• 5.6 發(fā)酵結果與討論72-74
• 第六章 結論與展望74-76
• 6.1 結論74-75
• 6.2 展望75-76
• 參考文獻76-82
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明82-83
• 致謝83-84

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本文編號：298758