本文關鍵詞：精胺修飾糖脂共聚物介導基因治療研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：殼聚糖-硬脂酸嫁接物(Chitosan-g-stearic acid,CS-SA)具有較強的腫瘤細胞攝取和亞細胞器轉運能力,可密接質粒DNA,實現(xiàn)基因有效轉染和抗腫瘤基因治療。研究表明,殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束可密接基因藥物轉運進入靶細胞,受較弱質子緩沖能力的限制,該嫁接物膠束存在內(nèi)-溶酶體逃逸問題,影響轉染效率。為增強基因載體的質子緩沖能力,促進基因給藥系統(tǒng)的內(nèi)-溶酶體逃逸,本研究選用精胺進一步修飾殼聚糖-硬脂酸,構建精胺-硬脂酸-殼聚糖/質粒DNA基因遞送系統(tǒng),考察精胺對基因轉染效率和p53基因治療的影響,并探討其相關機理。選擇酶法降解制備低分子量殼聚糖(Chitosan,CS)；碳二亞胺法合成殼聚糖-硬脂酸嫁接物(Chitosan-g-stearic acid,CS-SA)；高碘酸法合成精胺-殼聚糖-硬脂酸嫁接物(Spermine modified chitosan-g-stearic acid,SP-CS-SA)。核磁共振氫譜確證嫁接物化學結構。三硝基苯磺酸法測得CS-SA的氨基取代度為3.76%；元素分析法測得CS-SA六元糖環(huán)開環(huán)比例為12.42%,SP-CS-SA的精胺(SP)嫁接比例為7.59%。芘熒光法測得CS-SA、SP-CS-SA臨界膠束濃度分別為116.3±16.3μg/mL、108.2±3.8μg/mL。微粒粒度與Zeta電位分析儀測得CS-SA、SP-CS-SA膠束(濃度均為0.2 mg/mL)的數(shù)均粒徑分別為133.6±23.2 nm、128.4±19.8nm,表面電位分別為22.8±3.2mV、18.2±1.8 mV。透射電子顯微鏡觀察,顯示兩種膠束的粒徑分布均較窄,外觀呈不規(guī)則類球形,其粒徑略小于由微粒粒度與Zeta電位分析儀測定的結果。酸堿滴定法測得,SP修飾后CS-SA的離子緩沖能力有較大提高。CS-SA、Sp-CS-SA的EC-1、Bel-7402細胞毒性,均明顯小于Lipofectamine TM2000和PEI 25K。共孵育法分別制備殼聚糖-硬脂酸/pDNA(CS-SA/pDNA)、精胺-殼聚糖-硬脂酸/pDNA (SP-CS-SA/pDNA)基因遞送系統(tǒng)。CS-SA/pDNA、SP-CS-SA/pDNA均可有效密接pDNA,形成粒徑均一的基因遞送系統(tǒng)�；蜻f送系統(tǒng)具有良好的保護pDNA免受酶降解的能力。SP-CS-SA/pEGFP-C1的EC-1、Bel-7402細胞轉染效率,分別為44.6±4.9%,33.5±2.3%,顯著高于CS-SA/pEGFP-Cl (***P0.001),顯示SP修飾顯著提高了基因轉染效率。細胞內(nèi)共定位研究表明, 經(jīng)SP修飾的SP-CS-SA/pDNA基因遞送系統(tǒng),可實現(xiàn)DNA從溶酶體的快速逃逸。研究結果顯示,轉染劑量條件下的CS-SA/pDNA、SP-CS-SA/pDNA,基本無細胞毒性。以Bel-7402為模型細胞,p53-EGFP-N1為治療基因,考察CS-SA/P53-EGFP-N1、SP-CS-SA/p53-EGFP-N1基因遞送系統(tǒng)的促腫瘤細胞凋亡作用。研究結果表明,SP-CS-SA/p53-EGFP-N1的Bel-7402細胞凋亡率為37.3±1.1%,明顯大于CS-SA/p53-EGFP-N1 (10.1 ± 3.0%) (**P0.01),接近于PEI25K/p53-EGFP-N1,但低于LipofectamineTM2000/p53-EGFP-N1 (P0.05).選擇SP修飾,可促進SP-CS-SA/p53-EGFP-N1基因表達,引起腫瘤細胞G1期阻滯,促進細胞凋亡。
【關鍵詞】：精胺-殼聚糖 硬脂酸嫁接物 細胞攝取 內(nèi)-溶酶體逃逸 基因轉染 p53 細胞凋亡
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R943
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第1章 精胺-殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成及其理化性質研究14-32
• 1.1 試劑與儀器14-15
• 1.1.1 試劑14-15
• 1.1.2 儀器15
• 1.2 實驗方法15-19
• 1.2.1 低分子量殼聚糖的制備及分子量測定15-16
• 1.2.2 殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成16
• 1.2.3 精胺-殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成16-17
• 1.2.4 核磁共振分析17
• 1.2.5 氨基取代度測定17
• 1.2.6 元素分析17
• 1.2.7 臨界膠束濃度測定17-18
• 1.2.8 粒徑與表面電位測定18
• 1.2.9 透射電子顯微鏡觀察18
• 1.2.10 離子緩沖能力考察18
• 1.2.11 細胞培養(yǎng)與細胞毒性18-19
• 1.2.11.1 細胞培養(yǎng)18-19
• 1.2.11.2 細胞毒性實驗19
• 1.3 結果與討論19-30
• 1.3.1 殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成及結構確證19-21
• 1.3.2 精胺-殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成及結構確證21-22
• 1.3.3 氨基取代度與精胺嫁接比例22-23
• 1.3.4 臨界膠束濃度23-25
• 1.3.5 粒徑與表面電位25-26
• 1.3.6 透射電子顯微鏡觀察26-27
• 1.3.7 離子緩沖能力27-28
• 1.3.8 細胞毒性28-30
• 1.4 小結30-32
• 第2章 精胺-殼聚糖-硬脂酸嫁接物/pDNA復合物的制備及基因轉染研究32-52
• 2.1 試劑與儀器32-33
• 2.1.1 試劑32-33
• 2.1.2 儀器33
• 2.2 實驗方法33-37
• 2.2.1 嫁接物/pDNA復合物的制備33
• 2.2.2 粒徑與表面電位測定33-34
• 2.2.3 透射電子顯微鏡觀察34
• 2.2.4 凝膠阻滯分析34
• 2.2.5 酶保護實驗34
• 2.2.6 體外基因轉染34-35
• 2.2.6.1 胞培養(yǎng)34
• 2.2.6.2 基因轉染及熒光觀察34-35
• 2.2.6.3 基因轉染流式定量研究35
• 2.2.7 胞攝取與細胞內(nèi)定位35-37
• 2.2.7.1 嫁接物熒光標記35-36
• 2.2.7.2 細胞攝取與熒光觀察36
• 2.2.7.3 胞內(nèi)定位36-37
• 2.2.8 細胞毒性37
• 2.3 結果與討論37-49
• 2.3.1 粒徑與表面電位37-38
• 2.3.2 透射電子顯微鏡觀察38-39
• 2.3.3 凝膠阻滯分析39-40
• 2.3.4 酶保護實驗40-41
• 2.3.5 體外基因轉染41-45
• 2.3.6 細胞攝取及細胞內(nèi)定位45-49
• 2.3.7 胞毒性49
• 2.4 小結49-52
• 第3章 精胺-殼聚糖-硬脂酸嫁接物/p53的基因治療研究52-60
• 3.1 試劑與儀器52-53
• 3.1.1 試劑52
• 3.1.2 儀器52-53
• 3.2 實驗方法53-54
• 3.2.1 細胞培養(yǎng)53
• 3.2.2 p53-EGFP-N1體外基因轉染53
• 3.2.3 細胞凋亡53
• 3.2.4 細胞周期53-54
• 3.3 結果與討論54-57
• 3.3.1 p53-EGFP-N1體外基因轉染54-55
• 3.3.2 細胞凋亡55-56
• 3.3.3 細胞周期56-57
• 3.4 小結57-60
• 結論60-62
• 參考文獻62-68
• 綜述68-82
• 參考文獻78-82
• 作者簡歷82

【參考文獻】

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1 葉軼青,胡富強,袁弘;殼寡糖嫁接硬脂酸陽離子聚合物膠團的制備及其理化性質[J];藥學學報;2004年06期

  本文關鍵詞：精胺修飾糖脂共聚物介導基因治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：298428