本文關(guān)鍵詞：GDF-15誘導(dǎo)iTregs分化及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人類的健康和生命,如何治療惡性腫瘤是人類醫(yī)學(xué)所面臨的的重大難題。腫瘤免疫治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后被逐漸認(rèn)可的一種新興治療方法,然而腫瘤細(xì)胞躲避免疫細(xì)胞殺傷從而生長并進(jìn)一步轉(zhuǎn)移、侵襲即腫瘤免疫逃逸是腫瘤免疫治療的最大障礙。具有抑制性功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在腫瘤免疫逃逸中扮演著關(guān)鍵角色[1]。我們實驗室前期通過噬菌體肽庫篩技術(shù)篩選出可與免疫細(xì)胞表面結(jié)合的一系列腫瘤源性分子,其中TGF-β超家族成員GDF-15最為引起我們的關(guān)注。有研究顯示GDF-15在血清中的含量與腫瘤的分期相關(guān)[2],且根據(jù)文獻(xiàn)報道,在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤浸潤的T淋巴細(xì)胞中,Treg比例明顯升高[3],我們課題組在前期實驗中在結(jié)直腸癌患者體內(nèi),外周Tregs數(shù)量與血清中GDF-15的水平隨腫瘤的惡性程度升高而增加,且首次發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清GDF-15水平與Treg比例兩者呈現(xiàn)正相關(guān),同時,文獻(xiàn)報道GDF-15能夠促Foxp3表達(dá)量上調(diào)[4],而Foxp3[5]作為Treg特異的分子標(biāo)志,在Treg的發(fā)育與功能中起著至關(guān)重要的作用。因此我們推測,GDF-15在i Treg的誘導(dǎo)分化中可能具有重要作用。我們擬通過實時定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等實驗方法闡明GDF-15作用于na?ve CD4+T細(xì)胞使其向i Treg分化的誘導(dǎo)作用,探索GDF-15在誘導(dǎo)i Treg分化中的分子機(jī)制。方法:本課題計劃從以下三方面進(jìn)行研究:1、系統(tǒng)研究GDF-15誘導(dǎo)na?ve CD4+T細(xì)胞foxp3表達(dá)量升高。利用免疫磁珠法從人外周血中分離得到na?ve CD4+T細(xì)胞,加入GDF-15刺激,利用Real-time PCR及流式細(xì)胞術(shù)等實驗方法證實GDF-15在m RNA水平上和蛋白水平上均能上調(diào)Foxp3,同時研究GDF-15對于上調(diào)foxp3有無時象特點;2、進(jìn)一步確認(rèn)GDF-15誘導(dǎo)后的na?ve CD4+T細(xì)胞能否向i Treg方向分化,即具有i Treg的表型和功能,我們通過實時定量PCR、ELISA和流式細(xì)胞術(shù)等實驗方法分析了GDF-15刺激后的na?ve CD4+T細(xì)胞i Treg相關(guān)抑制性膜分子的表達(dá)水平,以及相關(guān)抑制性細(xì)胞因子的分泌水平。3、在進(jìn)一步的GDF-15作用機(jī)制研究中,我們通過激光共聚焦、實時定量PCR、Western blot和雙熒光素酶報告基因結(jié)合生物信息學(xué)分析,分析并闡明GDF-15誘導(dǎo)na?ve CD4+T細(xì)胞向i Tregs分化的分子機(jī)制。結(jié)果:通過以上實驗我們得到了下列結(jié)果:1、GDF-15能夠誘導(dǎo)na?ve CD4+T細(xì)胞foxp3表達(dá)量上調(diào),在第一天就能觀察到foxp3表達(dá)上調(diào),在第三天出現(xiàn)顯著變化。且在na?ve CD4+T細(xì)胞活化后兩天內(nèi)加入GDF-15刺激時,foxp3表達(dá)也可以上調(diào),在活化兩天以后再加入GDF-15刺激后,則無法上調(diào)foxp3表達(dá)。GDF-15刺激na?ve CD4+T細(xì)胞活化后不同時間點撤去GDF-15刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在撤去GDF-15刺激2天后,Foxp3上調(diào)比例均有所下降。2、加入GDF-15刺激后,na?ve CD4+T細(xì)胞在m RNA水平和蛋白水平上均高表達(dá)i Treg表面膜分子CD103、CD25、GITR等。同時,ELISA實驗結(jié)果說明,抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等在GDF-15刺激后也明顯表達(dá)上調(diào)。以上實驗結(jié)果顯示,誘導(dǎo)后na?ve CD4+T細(xì)胞具有了i Treg樣表型。3、根據(jù)文獻(xiàn)提示[6],我們推測GDF-15可能通過結(jié)合TGF-βRII發(fā)揮作用。因此我們用TGF-βRII中和抗體對細(xì)胞表面的受體進(jìn)行封閉,進(jìn)而檢測GDF-15是否依舊能夠上調(diào)Foxp3。實時定量PCR結(jié)果顯示,foxp3表達(dá)水平較未加受體抗體封閉組高,且激光共聚焦實驗結(jié)果與Real-time PCR相符,提示我們GDF-15通過TGF-βRII發(fā)揮作用。我們利用了Smad通路抑制劑SB431542以及ERK通路抑制劑PD98059對Smad通路和ERK通路分別進(jìn)行阻斷,實時定量PCR結(jié)果表明,阻斷Smad通路GDF-15刺激后foxp3表達(dá)量明顯弱于GDF-15刺激組,而阻斷ERK通路,GDF-15能夠更加明顯上調(diào)foxp3,Western blot結(jié)果也與實時定量PCR結(jié)果相一致。結(jié)果說明,GDF-15可以通過活化Smad通路進(jìn)行信號傳導(dǎo),加入中和抗體封閉TGF-βRII后,Smad通路活化被抑制。對于ERK通路來說,GDF-15可以抑制ERK通路的活化,TGF-β受體封閉后GDF-15對ERK通路抑制狀態(tài)也發(fā)生了部分逆轉(zhuǎn)。雙熒光素酶報告基因結(jié)果提示我們GDF-15上調(diào)Foxp3表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合于Foxp3啟動子的-1657bp至-1210bp處,結(jié)合生物信息學(xué)及實時定量PCR結(jié)果,我們推測GDF-15可能通過NFAT和CREB轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。結(jié)論:GDF-15能夠誘導(dǎo)na?ve CD4+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)上調(diào);促進(jìn)其向i Treg方向分化,同時能夠表達(dá)i Treg相關(guān)抑制性膜分子和分泌抑制性細(xì)胞因子;間接證實了GDF-15通過與TGF-βRII結(jié)合,激活Smad通路同時抑制ERK通路從而誘導(dǎo)i Treg分化。GDF-15可以誘導(dǎo)在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)的Treg的分化,提示GDF-15在腫瘤免疫逃逸中可能發(fā)揮重要作用,為未來打破腫瘤免疫逃逸狀態(tài)從而治愈惡性腫瘤提供新思路與新方法。
【關(guān)鍵詞】：GDF-15 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 腫瘤免疫逃逸
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-13
• 文獻(xiàn)回顧13-25
• 實驗一 系統(tǒng)研究GDF-15上調(diào)na?ve CD4~+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)量25-35
• 引言25
• 1 實驗材料25-27
• 2 實驗方法27-31
• 3 實驗結(jié)果31-34
• 4 討論34-35
• 實驗二GDF-15誘導(dǎo)na?ve CD4~+T細(xì)胞向i Treg分化35-46
• 引言35
• 1 實驗材料35-36
• 2 實驗方法36-40
• 3 實驗結(jié)果40-44
• 4 討論44-46
• 實驗三GDF-15誘導(dǎo)na?ve CD4~+T細(xì)胞向i Treg分化機(jī)制研究46-60
• 引言46
• 1 實驗材料46-48
• 2 實驗方法48-51
• 3 實驗結(jié)果51-58
• 4 討論58-60
• 小結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 附錄66-67
• 致謝67

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 梁建明;鐘永;蔡建強(qiáng);馬潔;張叔人;;胰腺癌患者外周血CD4~+ CD25~(high)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分析[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年10期

2 梁建明;孫青;鐘永;解亦斌;馬潔;張叔人;;胃癌患者外周血CD4~+ CD25~(high)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率及表型特征研究[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年09期

3 ;Dysfunction of Murine Dendritic Cells Induced by Incubation with Tumor Cells[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年02期

4 吳春健;王佃云;初晶學(xué);;乳腺癌患者外周血CD_4~+CD_(25)~+ Treg細(xì)胞及Th1/Th2類細(xì)胞因子水平測定及意義[J];山東醫(yī)藥;2010年35期

5 董張麗;楊麗娟;賴東梅;;免疫對腫瘤的負(fù)向調(diào)控[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2011年05期

6 殷勤勤;張仁峰;饒威;宋飛飛;席曄斌;張慧珍;葛海良;;新型腫瘤相關(guān)抗原OVA12單抗的制備及其在多種腫瘤中的應(yīng)用[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2014年04期

7 范燁;陸云杰;魯皓;張峰;李國強(qiáng);呂凌;;miRNA-155對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型和功能的影響[J];器官移植;2014年05期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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3 劉瀾濤;輻射誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型改變及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制的初步研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2013年

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 荊結(jié)線;卵巢癌患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的測定以及與細(xì)胞因子關(guān)系的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

2 葉菲;Tr1調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝免疫耐受中的作用及機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

3 劉暢;雌激素對淋巴細(xì)胞增殖的影響及其誘導(dǎo)抗原特異性CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2009年

4 武春燕;OVA免疫耐受因子制備及其免疫活性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2009年

5 陳麗;乙型慢加亞急性肝衰竭患者IL-35的表達(dá)及其與FOXP3的關(guān)系[D];蘇州大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：GDF-15誘導(dǎo)iTregs分化及其機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：297105