本文關鍵詞：GDF-15誘導iTregs分化及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:惡性腫瘤嚴重危害著人類的健康和生命,如何治療惡性腫瘤是人類醫(yī)學所面臨的的重大難題。腫瘤免疫治療成為繼手術、放療、化療之后被逐漸認可的一種新興治療方法,然而腫瘤細胞躲避免疫細胞殺傷從而生長并進一步轉移、侵襲即腫瘤免疫逃逸是腫瘤免疫治療的最大障礙。具有抑制性功能的調節(jié)性T細胞(Treg)在腫瘤免疫逃逸中扮演著關鍵角色[1]。我們實驗室前期通過噬菌體肽庫篩技術篩選出可與免疫細胞表面結合的一系列腫瘤源性分子,其中TGF-β超家族成員GDF-15最為引起我們的關注。有研究顯示GDF-15在血清中的含量與腫瘤的分期相關[2],且根據(jù)文獻報道,在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤浸潤的T淋巴細胞中,Treg比例明顯升高[3],我們課題組在前期實驗中在結直腸癌患者體內,外周Tregs數(shù)量與血清中GDF-15的水平隨腫瘤的惡性程度升高而增加,且首次發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清GDF-15水平與Treg比例兩者呈現(xiàn)正相關,同時,文獻報道GDF-15能夠促Foxp3表達量上調[4],而Foxp3[5]作為Treg特異的分子標志,在Treg的發(fā)育與功能中起著至關重要的作用。因此我們推測,GDF-15在i Treg的誘導分化中可能具有重要作用。我們擬通過實時定量PCR、流式細胞術、ELISA等實驗方法闡明GDF-15作用于na?ve CD4+T細胞使其向i Treg分化的誘導作用,探索GDF-15在誘導i Treg分化中的分子機制。方法:本課題計劃從以下三方面進行研究:1、系統(tǒng)研究GDF-15誘導na?ve CD4+T細胞foxp3表達量升高。利用免疫磁珠法從人外周血中分離得到na?ve CD4+T細胞,加入GDF-15刺激,利用Real-time PCR及流式細胞術等實驗方法證實GDF-15在m RNA水平上和蛋白水平上均能上調Foxp3,同時研究GDF-15對于上調foxp3有無時象特點;2、進一步確認GDF-15誘導后的na?ve CD4+T細胞能否向i Treg方向分化,即具有i Treg的表型和功能,我們通過實時定量PCR、ELISA和流式細胞術等實驗方法分析了GDF-15刺激后的na?ve CD4+T細胞i Treg相關抑制性膜分子的表達水平,以及相關抑制性細胞因子的分泌水平。3、在進一步的GDF-15作用機制研究中,我們通過激光共聚焦、實時定量PCR、Western blot和雙熒光素酶報告基因結合生物信息學分析,分析并闡明GDF-15誘導na?ve CD4+T細胞向i Tregs分化的分子機制。結果:通過以上實驗我們得到了下列結果:1、GDF-15能夠誘導na?ve CD4+T細胞foxp3表達量上調,在第一天就能觀察到foxp3表達上調,在第三天出現(xiàn)顯著變化。且在na?ve CD4+T細胞活化后兩天內加入GDF-15刺激時,foxp3表達也可以上調,在活化兩天以后再加入GDF-15刺激后,則無法上調foxp3表達。GDF-15刺激na?ve CD4+T細胞活化后不同時間點撤去GDF-15刺激,結果發(fā)現(xiàn)在撤去GDF-15刺激2天后,Foxp3上調比例均有所下降。2、加入GDF-15刺激后,na?ve CD4+T細胞在m RNA水平和蛋白水平上均高表達i Treg表面膜分子CD103、CD25、GITR等。同時,ELISA實驗結果說明,抑制性細胞因子IL-10、TGF-β等在GDF-15刺激后也明顯表達上調。以上實驗結果顯示,誘導后na?ve CD4+T細胞具有了i Treg樣表型。3、根據(jù)文獻提示[6],我們推測GDF-15可能通過結合TGF-βRII發(fā)揮作用。因此我們用TGF-βRII中和抗體對細胞表面的受體進行封閉,進而檢測GDF-15是否依舊能夠上調Foxp3。實時定量PCR結果顯示,foxp3表達水平較未加受體抗體封閉組高,且激光共聚焦實驗結果與Real-time PCR相符,提示我們GDF-15通過TGF-βRII發(fā)揮作用。我們利用了Smad通路抑制劑SB431542以及ERK通路抑制劑PD98059對Smad通路和ERK通路分別進行阻斷,實時定量PCR結果表明,阻斷Smad通路GDF-15刺激后foxp3表達量明顯弱于GDF-15刺激組,而阻斷ERK通路,GDF-15能夠更加明顯上調foxp3,Western blot結果也與實時定量PCR結果相一致。結果說明,GDF-15可以通過活化Smad通路進行信號傳導,加入中和抗體封閉TGF-βRII后,Smad通路活化被抑制。對于ERK通路來說,GDF-15可以抑制ERK通路的活化,TGF-β受體封閉后GDF-15對ERK通路抑制狀態(tài)也發(fā)生了部分逆轉。雙熒光素酶報告基因結果提示我們GDF-15上調Foxp3表達的轉錄因子可結合于Foxp3啟動子的-1657bp至-1210bp處,結合生物信息學及實時定量PCR結果,我們推測GDF-15可能通過NFAT和CREB轉錄因子發(fā)揮作用。結論:GDF-15能夠誘導na?ve CD4+T細胞Foxp3表達上調;促進其向i Treg方向分化,同時能夠表達i Treg相關抑制性膜分子和分泌抑制性細胞因子;間接證實了GDF-15通過與TGF-βRII結合,激活Smad通路同時抑制ERK通路從而誘導i Treg分化。GDF-15可以誘導在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮負性調節(jié)的Treg的分化,提示GDF-15在腫瘤免疫逃逸中可能發(fā)揮重要作用,為未來打破腫瘤免疫逃逸狀態(tài)從而治愈惡性腫瘤提供新思路與新方法。
【關鍵詞】：GDF-15 調節(jié)性T細胞 腫瘤免疫逃逸
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-25
• 實驗一 系統(tǒng)研究GDF-15上調na?ve CD4~+T細胞Foxp3表達量25-35
• 引言25
• 1 實驗材料25-27
• 2 實驗方法27-31
• 3 實驗結果31-34
• 4 討論34-35
• 實驗二GDF-15誘導na?ve CD4~+T細胞向i Treg分化35-46
• 引言35
• 1 實驗材料35-36
• 2 實驗方法36-40
• 3 實驗結果40-44
• 4 討論44-46
• 實驗三GDF-15誘導na?ve CD4~+T細胞向i Treg分化機制研究46-60
• 引言46
• 1 實驗材料46-48
• 2 實驗方法48-51
• 3 實驗結果51-58
• 4 討論58-60
• 小結60-61
• 參考文獻61-66
• 附錄66-67
• 致謝67

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 梁建明;鐘永;蔡建強;馬潔;張叔人;;胰腺癌患者外周血CD4~+ CD25~(high)調節(jié)性T細胞分析[J];蚌埠醫(yī)學院學報;2009年10期

2 梁建明;孫青;鐘永;解亦斌;馬潔;張叔人;;胃癌患者外周血CD4~+ CD25~(high)調節(jié)性T細胞比率及表型特征研究[J];蚌埠醫(yī)學院學報;2010年09期

3 ;Dysfunction of Murine Dendritic Cells Induced by Incubation with Tumor Cells[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年02期

4 吳春健;王佃云;初晶學;;乳腺癌患者外周血CD_4~+CD_(25)~+ Treg細胞及Th1/Th2類細胞因子水平測定及意義[J];山東醫(yī)藥;2010年35期

5 董張麗;楊麗娟;賴東梅;;免疫對腫瘤的負向調控[J];現(xiàn)代免疫學;2011年05期

6 殷勤勤;張仁峰;饒威;宋飛飛;席曄斌;張慧珍;葛海良;;新型腫瘤相關抗原OVA12單抗的制備及其在多種腫瘤中的應用[J];現(xiàn)代免疫學;2014年04期

7 范燁;陸云杰;魯皓;張峰;李國強;呂凌;;miRNA-155對調節(jié)性T細胞表型和功能的影響[J];器官移植;2014年05期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 黃慧;結節(jié)病患者Th17細胞和Treg細胞的表達水平及糖皮質激素治療干預的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

2 高豐光;尼古丁刺激DCs抗腫瘤機制及腫瘤微環(huán)境DCs失能研究[D];上海交通大學;2008年

3 劉瀾濤;輻射誘導調節(jié)性T細胞表型改變及其分子調節(jié)機制的初步研究[D];中國疾病預防控制中心;2013年

4 張業(yè)尼;光帽鱗傘抗腫瘤蛋白分離純化與表達及其作用機制研究[D];南開大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 荊結線;卵巢癌患者CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的測定以及與細胞因子關系的研究[D];山西醫(yī)科大學;2007年

2 葉菲;Tr1調節(jié)性T細胞在肝免疫耐受中的作用及機制研究[D];復旦大學;2008年

3 劉暢;雌激素對淋巴細胞增殖的影響及其誘導抗原特異性CD4~+CD25~+調節(jié)性T細胞的研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2009年

4 武春燕;OVA免疫耐受因子制備及其免疫活性研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2009年

5 陳麗;乙型慢加亞急性肝衰竭患者IL-35的表達及其與FOXP3的關系[D];蘇州大學;2010年

  本文關鍵詞：GDF-15誘導iTregs分化及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：297105