本文關(guān)鍵詞：七種立克次體甄別檢測基因芯片的研制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:立克次體(Rickettsiae)是一類除極少數(shù)外專性細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌,其引起的立克次體病是一類重要的急性發(fā)熱性人畜共患疾病。目前世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)具有致病性的立克次體有20余種,在我國,根據(jù)感染患者的病原體培養(yǎng)以及免疫學(xué)和分子診斷學(xué)檢測結(jié)果顯示,主要有10種立克次體病,包括:地方性斑疹傷寒、流行性斑疹傷寒、Q熱、恙蟲病、貓抓病、黑龍江蜱傳斑點熱、北亞蜱傳斑點熱、內(nèi)蒙古蜱傳斑點熱以及新發(fā)立克次體病人粒細胞無形體病(HGE)和人單核細胞埃立克體病(HME)等。近些年來,斑點熱新種的不斷出現(xiàn),埃立克體等新發(fā)立克次體的流行,都在提示立克次體病大規(guī)模流行和突然暴發(fā)的可能性。此外立克次體作為潛在的生物恐怖病原體,也日益受到重視,其中落基山斑點熱、Q熱以及流行性斑疹傷寒已被列為生物戰(zhàn)劑。因此,加強立克次體的監(jiān)測與防治具有重要的現(xiàn)實意義。本文旨在建立一種能同時檢測七種立克次體的化學(xué)發(fā)光基因芯片方法,為立克次體病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種新的高通量檢測手段。方法:1、根據(jù)前期文獻調(diào)研結(jié)果,確定本研究擬檢測的病原體及其靶基因。2、收集病原體樣本,無樣本的病原體人工合成基因片段,采用重疊延伸PCR的方法構(gòu)建其靶基因,然后制備質(zhì)粒參考品。3、設(shè)計合成特異性引物和探針,并進行篩選。4、通過調(diào)節(jié)體系成分以及引物濃度配比優(yōu)化多重PCR體系。5、制備陽性參考品和陰性參考品,評價芯片特異性;制備靈敏度參考品,評價靈敏度;芯片法與實時熒光PCR法同時檢測梯度稀釋的莫氏立克次體核酸,比較兩種方法的靈敏度;制備模擬樣本,評價芯片檢測全血樣本的準確性。結(jié)果:首先,根據(jù)文獻調(diào)研確定檢測的7種常見立克次體(莫氏立克次體、查菲埃立克體、普氏立克次體、斑點熱群立克次體、柯克斯氏體、恙蟲病東方體、嗜吞噬細胞無形體)。構(gòu)建出7種立克次體的質(zhì)粒參考品。對芯片的引物探針進行了篩選。共篩選出1對通用引物、4對特異性引物、8條特異性探針和1條立克次體屬通用探針用來擴增和檢測立克次體。對芯片的多重PCR體系進行了優(yōu)化,重點優(yōu)化了引物濃度配比和引物組合,確保全部靶基因均可以良好的擴增。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果,芯片共分為兩組三重PCR體系;建立了立克次體化學(xué)發(fā)光基因芯片檢測方法。最后,評價了芯片的關(guān)鍵性能指標。特異性評價結(jié)果顯示,該芯片可以良好的甄別檢測上述7種立克次體。該芯片檢測質(zhì)粒DNA的靈敏度為1.5×102-3×103copies/反應(yīng),檢測模擬樣本的靈敏度為103-104 copies/μl。模擬樣本檢測結(jié)果表明:檢測符合率為100%。結(jié)論:成功建立了可同時甄別七種立克次體的化學(xué)發(fā)光基因芯片檢測方法,特異性和靈敏度評價結(jié)果表明該芯片已達到預(yù)期的性能要求。可為立克次體病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種新的高通量檢測手段。
【關(guān)鍵詞】：立克次體 基因芯片 多重PCR 化學(xué)發(fā)光 甄別檢測
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440;R96
【目錄】：

• 中英文對照表4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-15
• 一材料與方法15-24
• 1 材料和儀器15-16
• 2 方法16-24
• 二結(jié)果24-35
• 1 病原體和靶基因的選擇24
• 2 重疊延伸法構(gòu)建含病原體靶基因序列質(zhì)粒24-25
• 3 引物設(shè)計與篩選25-27
• 4 探針設(shè)計與篩選27-29
• 5 多重PCR的建立與優(yōu)化29-30
• 6 芯片特異性評價30-32
• 7 芯片靈敏度評價32-33
• 8 模擬樣本檢測33-34
• 9 芯片判讀標準的制定34-35
• 三討論35-37
• 四結(jié)論37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻39-44
• 附錄一：文獻綜述44-54
• 參考文獻50-54
• 附錄二：在校期間論文論著和科研情況54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：七種立克次體甄別檢測基因芯片的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：286931