本文關(guān)鍵詞：缺第4外顯子的IL-7剪接變異體蛋白的活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白細(xì)胞介素7(interleukin-7,IL-7)的全長(zhǎng)基因全長(zhǎng)包含6個(gè)外顯子(531bp),當(dāng)受某些因素影響導(dǎo)致其中的一個(gè)或幾個(gè)外顯子被跳過,便形成了許多長(zhǎng)短不一的、來(lái)源相同基因的m RNA,從而產(chǎn)生新的不同IL-7剪接變異體蛋白。IL-7δ4是IL-7缺第4外顯子的剪接變異體,其一級(jí)結(jié)構(gòu)與IL-7有差異,其功能可能參與IL-7功能調(diào)節(jié),甚至獲得新功能或與IL-7功能相拮抗。正常人體內(nèi)多個(gè)器官都能檢測(cè)到IL-7δ4m RNA,但其生物功能尚未清楚。此外,在多個(gè)腫瘤細(xì)胞株、多發(fā)性硬化癥病人中其m RNA水平異常增高,IL-7δ4是否參與了相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展亦有待研究。目的:本文將利用原核表達(dá)載體p ET-21b表達(dá)IL-7δ4,經(jīng)復(fù)性、純化及Westren-blot鑒定,獲得具有生物活性的IL-7δ4蛋白,并對(duì)其活性功能進(jìn)行研究,這對(duì)其正常生理功能的探討、相關(guān)疾病的及時(shí)診治都具有十分重要意義。方法:1.rh IL-7δ4蛋白的制備:利用本室保存的18-T-IL-7δ4為模板進(jìn)行亞克隆,構(gòu)建rh IL-7δ4原核表達(dá)載體p ET-21b-IL-7δ4,對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析,并優(yōu)化表達(dá)條件。rh IL-7δ4蛋白以包涵體形式表達(dá),采用梯度透析法進(jìn)行復(fù)性,并經(jīng)過親和層析色譜法純化。最后,分別以6×His小鼠單克隆抗體和鼠抗人IL-7抗體為一抗,對(duì)純化后rh IL-7δ4蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。2.rh IL-7δ4蛋白對(duì)正常人外周血單核細(xì)胞的作用:BCA法測(cè)定其濃度后,以rh IIL-7為陽(yáng)性對(duì)照研究rh IIL-7δ4的活性,采用Western-bolt法檢測(cè)其對(duì)外周血單核細(xì)胞凋亡蛋白BCL-2表達(dá),以及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析其對(duì)人外周血單核細(xì)胞凋亡的影響。3.rh IL-7δ4蛋白對(duì)肺成纖維細(xì)胞MCR-5的影響:以TGF-β1、rh IL-7、rh IL-7δ4干預(yù)MCR-5細(xì)胞,MTT法檢測(cè)其增殖率,以及Western-blot法檢測(cè)collagen I、α-SMA蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.rh IL-7δ4蛋白的原核表達(dá)、復(fù)性及純化:成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-21b-IL-7δ4。PCR可擴(kuò)增出約399bp的目的片段,與預(yù)期的一致,且測(cè)序結(jié)果與Gen Bank中IL-7δ4基因序列比較,彼此完全吻合。通過稀釋與梯度透析過程,rh IL-7δ4蛋白的復(fù)性效率可達(dá)65%,純化后其純度均達(dá)到了95%以上,且純化樣品經(jīng)Western Blot證實(shí)為rh IL-7δ4。2.rh IL-7δ4蛋白對(duì)正常人PBMCs的作用:在體外,rh IL-7δ4能明顯提高PBMC的BCL-2蛋白表達(dá),抑制PBMCs的凋亡(P0.01),與rh IL-7作用是一致的。3.rh IL-7δ4蛋白對(duì)MCR-5細(xì)胞的作用:當(dāng)TGF-β1、rh IL-7、rh IL-7δ4分別作用于體外培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞,都促進(jìn)細(xì)胞增殖(P0.01),但作用強(qiáng)度有差異(TGF-β1rh IL-7δ4rh IL-7),且都能誘導(dǎo)細(xì)胞collagen I、α-SMA蛋白表達(dá)增加(P0.05)。當(dāng)TGF-β1分別與rh IL-7及rh IL-7δ4合用時(shí),上述的蛋白表達(dá)增加效應(yīng)更明顯,而預(yù)先用以IL-7R抗體處理MRC-5細(xì)胞,則能逆轉(zhuǎn)rh IL-7及rh IL-7δ4的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)論:本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)rh IL-7δ4蛋白,優(yōu)化其表達(dá)條件,經(jīng)過復(fù)性和純化,成功獲得高純度的rh IL-7δ4蛋白。在體外,rh IL-7δ4能明顯提高PBMC的BCL-2蛋白表達(dá),抑制PBMCs的凋亡,這表明rh IL-7δ4也參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。此外,rh IL-7δ4能誘導(dǎo)MCR-5增殖,上調(diào)其collagen I、α-SMA蛋白表達(dá),這提示rh IL-7δ4具有誘導(dǎo)纖維化的作用。
【關(guān)鍵詞】：缺乏第4外顯子的IL-7剪接變異體 原核表達(dá) 純化 活性鑒定
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 序言12-16
• 1.1 研究背景12-15
• 1.1.1 白細(xì)胞介素7及其剪接變異體12-13
• 1.1.2 選擇性剪接13-15
• 1.1.3 纖維化疾病15
• 1.2 研究思路15-16
• 第二章 剪接變異體蛋白rhIL-7δ4 的原核表達(dá)、純化以及鑒定16-38
• 2.1 前言16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料16-24
• 2.2.1 菌株16
• 2.2.2 主要試劑16-17
• 2.2.3 合成引物17
• 2.2.4 主要儀器設(shè)備17-18
• 2.2.5 主要溶液配制18-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-31
• 2.3.1 制備感受態(tài)DH5α 及BL2124
• 2.3.2 rhIL-7δ4 表達(dá)載體的構(gòu)建24-26
• 2.3.3 rhIL-7δ4 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化、可溶性鑒定26-27
• 2.3.4 rhIL-7δ4 蛋白變性與復(fù)性27-28
• 2.3.5 rhIL-7δ4 蛋白的純化28-30
• 2.3.6 rhIL-7δ4 蛋白Western-blot鑒定30-31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-36
• 2.4.1 成功構(gòu)建rhIL-7δ4 原核表達(dá)載體31-33
• 2.4.2 rhIL-7δ4 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化、可溶性分析33-34
• 2.4.3 rhIL-7δ4 蛋白的復(fù)性及純化34-35
• 2.4.4 Western-blot鑒定rhIL-7δ4 蛋白35-36
• 2.5 討論36-38
• 第三章 rhIL-7δ4 蛋白對(duì)人外周血單核細(xì)胞PBMCs的作用38-50
• 3.1 前言38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料38-41
• 3.2.1 人外周靜脈血38
• 3.2.2 主要試劑38-39
• 3.2.3 主要儀器設(shè)備39
• 3.2.4 主要溶液配制39-41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 3.3.1 rhIL-7δ4 蛋白的脫鹽和保存41
• 3.3.2 rhIL-7δ4 蛋白含量測(cè)定41-42
• 3.3.3 rhIL-7δ4 蛋白對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs） BCL-2 蛋白表達(dá)的影響42-44
• 3.3.4 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)44
• 3.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理44
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-48
• 3.4.1 rhIL-7δ4 蛋白穩(wěn)定性試驗(yàn)44-45
• 3.4.2 蛋白含量測(cè)定45-46
• 3.4.3 BCL-2 蛋白表達(dá)的檢測(cè)46-47
• 3.4.4 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)47-48
• 3.5 討論48-50
• 第四章 rhIL-7δ4 蛋白對(duì)肺成纖維細(xì)胞MRC-5 的作用50-63
• 4.1 前言50-51
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料51-53
• 4.2.1 細(xì)胞株51
• 4.2.2 主要試劑51
• 4.2.3 主要儀器設(shè)備51
• 4.2.4 主要溶液配制51-53
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法53-56
• 4.3.1 MRC-5 培養(yǎng)方法53-54
• 4.3.2 TGF-β1 對(duì)MRC-5 增殖及collagen I蛋白、α-SMA蛋白表達(dá)的影響54-55
• 4.3.3 rhIL-7δ4 蛋白對(duì)MRC-5 增殖及collagen I蛋白、α-SMA蛋白的影響55-56
• 4.3.4 抗IL-7R /CD127 抗體干預(yù)細(xì)胞MRC-5 后的影響56
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-61
• 4.4.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率56-57
• 4.4.2 Western Blot檢測(cè)collagen I蛋白、α-SMA蛋白的表達(dá)57-61
• 4.5 討論61-63
• 全文總結(jié)63-64
• 研究展望64-65
• 參考文獻(xiàn)65-73
• 攻讀學(xué)位期間科研情況73-74
• 附錄1英文縮寫語(yǔ)中文對(duì)照74-76
• 致謝76-77

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 彭羽瑜;陳鑒華;嚴(yán)思;李曉波;金小寶;朱家勇;潘德順;;重組人白細(xì)胞介素7蛋白的表達(dá)、復(fù)性和純化[J];免疫學(xué)雜志;2014年05期

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  本文關(guān)鍵詞：缺第4外顯子的IL-7剪接變異體蛋白的活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：285968