本文關(guān)鍵詞：阿霉素—血小板載藥體系的構(gòu)建及其抗淋巴瘤效應(yīng)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的以血小板為載體制備阿霉素-血小板載藥體系,研究其基本特性。觀察載藥后血小板形態(tài)、部分膜蛋白的表達及聚集功能的改變。觀察阿霉素搭乘血小板后對Raji細胞及Burkitt淋巴瘤裸鼠模型的作用,通過作用于新生裸鼠原代心肌細胞及Burkitt淋巴瘤裸鼠模型,考察心肌毒性。方法(1)將全血離心、洗滌得到洗滌血小板(platelet),與不同濃度的DOX充分混合反應(yīng),通過2B分離柱分離后得到包載阿霉素的血小板(DOX-platelet); (2)高效液相色譜儀、電子秤計算載藥率(drug loading, DL)和包封率(encapsulation efficiency, EE),熒光顯微鏡考察DOX是否被血小板包載,掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察DOX包載于血小板后對血小板的形態(tài)有無影響,蛋白印跡(western blotting)法檢測血小板膜蛋白CD41、CD61及CD47的表達,血小板聚集儀檢測血小板及包載阿霉素后血小板的聚集功能,體外透析實驗檢測DOX-platelet中DOX的釋放性能；(3)Cell counting kit-8試劑盒檢測不同濃度DOX對Raji細胞增殖抑制作用,計算IC50值作為實驗濃度,DOX-platelet組則根據(jù)載藥量計算,給予相當(dāng)于含等量DOX的DOX-platelet。將Platelet、DOX及DOX-platelet與Raji細胞株及新生裸鼠原代心肌細胞共培養(yǎng)24h、48h、72h后計算細胞增殖抑制率；(4)流式細胞儀(flow cytometry, FCM)檢測各實驗組細胞的凋亡率；(5)共聚焦顯微鏡觀察各實驗組經(jīng)DAPI染色后細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；(6)FCM檢測細胞內(nèi)DOX的藥物濃度。(7)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)法和、vestern法分別檢測各實驗組Bad、Bcl-xl、Caspase9、P53的基因和蛋白表達水平；(8)建立Burkitt淋巴瘤小鼠模型成功后將其分成Control、Platelet、DOX、DOX-platelet四個處理組,監(jiān)測各組裸鼠體重及瘤塊體積改變；(9)HE染色觀察各處理組裸鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及腫瘤的組織病理學(xué)改變；(10)RT-PCR法和western法分別檢測各實驗組裸鼠瘤體Bad、Bcl-xl、Caspase9、P53的基因和蛋白表達水平。結(jié)果(1)DOX-platelet的表征Ⅰ.DOX可以被包載于血小板內(nèi),且計算得DOX-platelet的載藥率為46.3%,包封率為86.6%；Ⅱ. DOX搭乘血小板后對血小板的形態(tài)無明顯影響,血小板和包載阿霉素后血小板的聚集功能及血小板膜蛋白CD41、CD47、D61表達量均無明顯改變(P0.05)；Ⅲ.在pH為5.5的環(huán)境中,36h內(nèi)DOX-platelet中DOX累積釋放率達到84.4%,而在pH=7.4及pH=8.4的環(huán)境中累積釋放率均小于40%。(2) Raji細胞及新生裸鼠原代心肌細胞增殖抑制率：Ⅰ. DOX對Raji細胞增殖的抑制作用呈明顯的時間和濃度依賴性,且計算得24h的IC50為0.243ug/ml;Ⅱ. Platelet組與Control組比較,對Raji細胞及原代心肌細胞增殖抑制率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；Ⅲ.作用Raji細胞24h、48h及72h后,DOX組對細胞增殖抑制率分別為(52.06±3.5)%、(61.90±4.0)%、(72.30±4.1)%,DOX-platelet組對細胞增殖抑制率為(65.80±3.0)%、(85.23±3.7)%、(90.60±3.4)%,兩組與空白對照組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義,且DOX-platelet組的作用更為顯著,與DOX組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(作用24h及48h的P0.05,作用72h的P0.01)；Ⅳ. DOX與DOX-platelet作用于原代心肌細胞24h、48h、72h,比較兩組對細胞增殖的抑制率后發(fā)現(xiàn),DOX-platelet組可明顯減輕對細胞的增殖抑制作用(P0.01)。(3)FCM檢測Raji細胞凋亡率及DAPI觀察Raji細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變：Ⅰ.作用Raji細胞24h后,Control、Platelet、DOX、DOX-platelet四組總凋亡率分別為(5.9±0.52)%,(14.6±1.21)%,(50.5±5.01)%和(73.1±8.37)%,DOX及DOX-platelet組細胞凋亡較Control組均明顯增加(P0.01),且DOX-platelet較DOX組增加更為明顯(P0.01)；Ⅱ. DOX及DOX-platelet兩組均可見到細胞凋亡的特征性改變,且在DOX-platelet組中可見到更多的凋亡小體及細胞碎片。(4)FCM檢測Raji細胞內(nèi)DOX濃度：DOX及DOX-platelet組細胞內(nèi)DOX濃度較Control組均增加(P0.01),且DOX-platelet與DOX比較增加更為顯著(P0.05)。(5) RT-PCR及western Blot法分別檢測Bad、Bcl-xl、Caspase9和P53基因和蛋白表達水平：DOX及DOX-platelet兩組與Control組比較,Bad、Caspase9和P53基因和蛋白表達水平均明顯上調(diào)(P0.05), Bcl-xl基因和蛋白表達水平明顯下調(diào)(P0.05),且DOX-platelet組的作用強于DOX組。(6)各治療組裸鼠體重及腫瘤體積變化Ⅰ.DOX及DOX-platelet兩組裸鼠腫瘤體積較Control組明顯下降(P0.01),且DOX-platelet組較DOX組更為顯著(P0.01)。Ⅱ.只有DOX組裸鼠體重較Control組顯著下降(P0.01),Platelet組及DOX-platelet組與Control組相比無明顯差異(P0.05)；(7)HE染色觀察各處理組裸鼠組織病理學(xué)改變除DOX組的心肌細胞可見不同程度的壞死變性及炎癥細胞浸潤等,其余各組各組織均未見到明顯改變。(8) RT-PCR法和western法檢測裸鼠腫瘤組織Bad、Bcl-xl、Caspase9和P53基因及蛋白表達水平DOX及DOX-platelet兩組與Control組比較,Bad、Caspase9和P53基因及蛋白表達水平均明顯上調(diào),Bcl-xl基因表達水平明顯下調(diào),且DOX-platelet組的作用強于DOX組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論(1)血小板包載阿霉素后其形態(tài)、部分膜蛋白表達及聚集功能均無明顯改變；(2)DOX-platelet可有效促進DOX對Raji細胞增殖的抑制作用、減輕DOX對新生裸鼠原代心肌細胞的抑制作用,可促進細胞凋亡,增加細胞內(nèi)DOX藥物濃度,上調(diào)Raji細胞Bad、Caspase9和P53基因和蛋白的表達水平,下調(diào)Bcl-xl的表達水平；(3)DOX-platelet可有效促進DOX抑制Burkitt淋巴瘤裸鼠腫瘤的生長,減輕對裸鼠心肌的損害,上調(diào)荷瘤裸鼠腫瘤組織Bad、Caspase9和P53基因和蛋白的表達水平,下調(diào)Bcl-xl的表達水平。
【關(guān)鍵詞】：載藥體系 血小板 阿霉素 淋巴瘤
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943;R96
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-15
• 第一部分 新型阿霉素-血小板載藥體系的構(gòu)建15-22
• 1 材料與方法15-16
• 2 實驗方法16-19
• 3.實驗結(jié)果19-22
• 第二部分 新型阿霉素-血小板載藥體系體外抗人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞的作用22-32
• 1 材料和儀器22-23
• 2 實驗方法23-27
• 3 實驗結(jié)果27-32
• 第三部分 新型阿霉素-血小板載藥體系體內(nèi)作用于淋巴瘤荷瘤裸鼠的作用32-37
• 1 材料與儀器32
• 2 實驗方法32-33
• 3 實驗結(jié)果33-37
• 討論37-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-47
• 文獻綜述 生物藥物載體在腫瘤治療中的研究進展47-61
• 參考文獻54-61
• 個人簡介61-62
• 致謝62

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本文編號：285454