本文關(guān)鍵詞：煙草中焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)和血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶相互作用的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：吸煙是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在臨床實(shí)踐及以往文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)吸煙可以導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成,引起急性心肌梗死的發(fā)生。但其機(jī)制目前并不清楚。內(nèi)皮細(xì)胞在維持血流通暢、抵抗血栓形成等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin,TM)是內(nèi)皮細(xì)胞表面具有很強(qiáng)抗凝活性的蛋白,它主要通過與凝血酶1:1的高親和力結(jié)合,激活蛋白C發(fā)揮抗凝作用。這一抗凝過程不但受TM表達(dá)量的影響,同時(shí)也受其與凝血酶相互作用的影響。目前體外觀察吸煙對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TM表達(dá)的研究較少,焦油、尼古丁作為煙草中兩種重要的有害物質(zhì),被人們廣泛研究,但罕見報(bào)道其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TM表達(dá)的影響。瑞舒伐他汀作為新一代的降脂藥,不僅具有調(diào)節(jié)血脂的功能,還具有抗炎,抗血栓,改善血管內(nèi)皮功能,穩(wěn)定斑塊等作用。但瑞舒伐他汀是否改善焦油與尼古丁對(duì)TM的表達(dá)并不清楚。另外,關(guān)于TM與凝血酶相互作用的研究,原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)單分子力譜(single-molecule force spectroscopy,SMFS)以其p N級(jí)的高分辨率實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞表面單分子水平作用力的測(cè)定而具有獨(dú)特的優(yōu)越性。雖然近年來采用原子力顯微鏡對(duì)于生物分子間相互作用的研究越來越多,并不斷獲得新的進(jìn)展,但是關(guān)于焦油與尼古丁對(duì)TM/凝血酶單分子間的相互作用及瑞舒伐他汀的干預(yù)的研究未見報(bào)道。第一部分焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響目的:研究不同條件下焦油與尼古丁對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖影響及表面TM表達(dá)的影響,從而探討吸煙導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成的可能機(jī)制。方法:以0.1%I型膠原酶消化人臍靜脈內(nèi)皮37℃15-20min,分離獲得原代HUVECs,在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)至融合后傳代,用VIII因子相關(guān)抗原鑒定HUVECs,2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1 CCK-8法檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs增殖的影響將HUVECs接種于96孔板,用不同濃度焦油(50mg/L,20 mg/L,10 mg/L,1 mg/L)、尼古丁(10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)不同時(shí)間(6h、24h)孵育細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入10ul CCK-8溶液37℃,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)1-4h,酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A值。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)的影響將HUVECs接種于6孔板,用不同濃度焦油(50mg/L、20mg/L、10mg/L、1mg/L)、尼古丁(10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)同一時(shí)間(6h)及同一濃度20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁不同時(shí)間(0h、1h、6h、12h、24h)孵育細(xì)胞。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)每組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度,檢測(cè)TM蛋白表達(dá),每次計(jì)數(shù)30000個(gè)細(xì)胞。3熒光定量PCR檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM m RNA表達(dá)的影響將HUVECs接種于6孔板,用不同濃度焦油(50mg/L、20mg/L、10mg/L、1mg/L)、尼古丁(10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)同一時(shí)間(6h)及同一濃度20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁不同時(shí)間(0h、1h、6h、12h、24h)孵育細(xì)胞。熒光定量PCR檢測(cè)TM m RNA表達(dá)。結(jié)果:1 CCK-8法檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs增殖的影響與對(duì)照組相比,不同濃度焦油6h、24h組均可觀察到隨濃度的升高,A值逐漸降低的趨勢(shì),但只有50mg/L焦油6h、24h組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。而不同濃度尼古丁6h、24h組與對(duì)照組相比可觀察到隨濃度的升高,A值逐漸升高的趨勢(shì),但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,不同濃度焦油組可以觀察到隨著焦油濃度的升高TM蛋白表達(dá)逐漸增加,呈濃度依賴性,而且10mg/L焦油組即可達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與0h相比,不同時(shí)間焦油組也可觀察到隨著時(shí)間的延長(zhǎng)TM蛋白表達(dá)逐漸增加,呈時(shí)間依賴性,而且6h即可達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。并且觀察到6h內(nèi)焦油組TM蛋白表達(dá)量增加最快,而隨時(shí)間延長(zhǎng),TM蛋白表達(dá)量增加速率則逐漸減慢。尼古丁組隨濃度、時(shí)間變化均對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)無影響。3熒光定量PCR檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM m RNA表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,不同濃度焦油組可以觀察到隨著焦油濃度的升高TM m RNA表達(dá)逐漸增加,呈濃度依賴性,而且1mg/L焦油組即可達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與0h相比,不同時(shí)間焦油組也可觀察到隨著時(shí)間的延長(zhǎng)TM m RNA表達(dá)逐漸增加,呈時(shí)間依賴性,而且1h即可達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。并且觀察到6h內(nèi)焦油組TM m RNA表達(dá)量增加最快,而隨時(shí)間延長(zhǎng),TM m RNA表達(dá)量增加速率則逐漸減慢。尼古丁組隨濃度、時(shí)間變化均對(duì)HUVECs表面TM m RNA表達(dá)無影響。結(jié)論:1焦油抑制HUVECs的增殖。尼古丁具有增強(qiáng)HUVECs增殖的趨勢(shì)。2焦油增加HUVECs表面TM的表達(dá),呈濃度、時(shí)間依賴性。尼古丁對(duì)HUVECs表面TM的表達(dá)無影響。第二部分瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)及活性的影響目的:研究瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs的增殖影響及表面TM表達(dá)及活性的影響,從而探討他汀類藥物改善吸煙致血管內(nèi)血栓形成的可能機(jī)制。方法:以0.1%I型膠原酶消化人臍靜脈內(nèi)皮37℃15-20min,分離獲得原代HUVECs,在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)至融合后傳代,第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1 CCK-8法檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs增殖的影響將HUVECs接種于96孔板,用50mg/L焦油、10-3mol/L尼古丁、50 mg/L焦油+50umol/L他汀,10-3mol/L尼古丁+50umol/L他汀,50umol/L他汀不同時(shí)間(6h、24h)孵育細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入10ul CCK-8溶液37℃,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)1-4h,酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A值。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)的影響將HUVECs接種于6孔板,用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20mg/L焦油+50umol/L他汀,10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀,50umol/L他汀孵育細(xì)胞。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)每組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度,檢測(cè)TM蛋白表達(dá),每次計(jì)數(shù)30000個(gè)細(xì)胞。3熒光定量PCR檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM m RNA表達(dá)的影響將HUVECs接種于6孔板,用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20 mg/L焦油+50umol/L他汀,10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀,50umol/L他汀孵育細(xì)胞。熒光定量PCR檢測(cè)TM m RNA表達(dá)。4 TM活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM活性的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)將HUVECs接種于96孔板,用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20 mg/L焦油+50umol/L他汀,10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀,50umol/L他汀不同時(shí)間(6h、24h)孵育細(xì)胞。酶標(biāo)儀405nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A值。結(jié)果:1 CCK-8法檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs增殖的影響與50mg/L焦油組相比,他汀+焦油組可增加吸光度A值(P0.05);但與對(duì)照組相比,他汀組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。他汀+尼古丁組與尼古丁組也無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,他汀組可增加HUVECs表面TM蛋白表達(dá)(P0.05);與焦油組相比,他汀+焦油組可增加HUVECs表面TM蛋白表達(dá)(P0.05);與尼古丁組相比,他汀+尼古丁組可增加HUVECs表面TM蛋白表達(dá)(P0.05)。3熒光定量PCR檢測(cè)瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM m RNA表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,他汀組可增加HUVECs表面TM m RNA表達(dá)(P0.05);與焦油組相比,他汀+焦油組可增加HUVECs表面TM m RNA表達(dá)(P0.05);與尼古丁組相比,他汀+尼古丁組可增加HUVECs表面TM m RNA表達(dá)(P0.05)。4 TM活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)HUVECs表面TM活性的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)與對(duì)照組相比,焦油組降低吸光度A值,降低TM的活性(P0.05);與焦油組相比,他汀+焦油組可增加吸光度A值(P0.05);而尼古丁組與對(duì)照組相比吸光度A值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,他汀+尼古丁組及他汀組與對(duì)照組相比可增加吸光度A值(P0.05)。結(jié)論:1瑞舒伐他汀能改善焦油抑制的HUVECs增殖,但本身對(duì)HUVECs的增殖無影響。2瑞舒伐他汀可增加HUVECs表面TM的表達(dá),并在焦油增加TM表達(dá)的基礎(chǔ)上,仍能再次上調(diào)TM的表達(dá)。3焦油降低TM活性,瑞舒伐他汀可改善這一效應(yīng),并且瑞舒伐他汀本身也可增加TM的活性。尼古丁對(duì)TM活性無影響。第三部分單分子力譜檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶相互作用的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)目的:利用單分子力譜法檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)TM與凝血酶單分子水平相互作用及瑞舒伐他汀的干預(yù),從而探討吸煙導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成及他汀類藥物抗血栓作用的可能機(jī)制。方法:1 p TM-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞及AFM分組測(cè)力實(shí)驗(yàn)分組:1)空白對(duì)照組(無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染);2)對(duì)照組(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染);3)50mg/L焦油孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組(焦油組);4)10-3mol/L尼古丁孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組(尼古丁組);5)50umol/L瑞舒伐他汀+50mg/L焦油孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組(他汀+焦油組);6)50umol/L瑞舒伐他汀+10-3mol/L尼古丁孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組(他汀+尼古丁組);7)50umol/L瑞舒伐他汀孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞1h組(他汀組)。采用AFM及熒光倒置顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng),在熒光倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞表達(dá)的TM熒光融合蛋白聚集區(qū),用凝血酶修飾的AFM探針反復(fù)隨機(jī)的在細(xì)胞表面蛋白聚集區(qū)下壓-回拉,獲得力-距離曲線,統(tǒng)計(jì)得出TM與凝血酶間結(jié)合力的高斯分布及成鍵幾率。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀對(duì)COS-7細(xì)胞表面TM熒光蛋白表達(dá)的影響將轉(zhuǎn)染后的COS-7細(xì)胞接種于6孔板,用50mg/L焦油、10-3mol/L尼古丁、50mg/L焦油+50umol/L他汀,10-3mol/L尼古丁+50umol/L他汀,50umol/L他汀孵育細(xì)胞1h。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)每組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度,檢測(cè)TM蛋白表達(dá),每次計(jì)數(shù)30000個(gè)細(xì)胞。結(jié)果:1 AFM檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)TM與凝血酶之間的相互作用及瑞舒伐他汀的干預(yù)與對(duì)照組相比,焦油組可明顯降低TM與凝血酶間結(jié)合幾率(P0.05),所得結(jié)合幾率低至5%,可視為分子間結(jié)合極低或無結(jié)合,無法計(jì)算TM與凝血酶間的分子結(jié)合力;與焦油組相比,他汀+焦油組可明顯增加TM與凝血酶間結(jié)合幾率(P0.05),達(dá)到與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?并且計(jì)算得出的他汀+焦油組的分子結(jié)合力明顯高于對(duì)照組(P0.05)。而尼古丁組與對(duì)照組相比在結(jié)合幾率和結(jié)合力上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;他汀+尼古丁組與尼古丁組相比結(jié)合幾率雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是結(jié)合力卻明顯增加(P0.05);他汀組與對(duì)照組相比結(jié)合幾率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但結(jié)合力明顯增加(P0.05)。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)COS-7細(xì)胞表面TM熒光蛋白表達(dá)的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)與對(duì)照組相比,焦油組與他汀+焦油組可明顯增加COS-7細(xì)胞表面TM表達(dá)(P0.05);尼古丁組、他汀組及尼古丁+他汀組與對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:1焦油能降低TM與凝血酶間結(jié)合幾率,瑞舒伐他汀可改善這一效應(yīng),但瑞舒伐他汀本身對(duì)TM與凝血酶間結(jié)合幾率無影響。尼古丁對(duì)TM與凝血酶間結(jié)合幾率及結(jié)合力均無影響。加入瑞舒伐他汀后,各組均能增加TM與凝血酶間結(jié)合力。2焦油可增加轉(zhuǎn)染后COS-7細(xì)胞表達(dá)TM,尼古丁、瑞舒伐他汀對(duì)轉(zhuǎn)染后COS-7細(xì)胞表達(dá)TM無影響。
【關(guān)鍵詞】：血栓調(diào)節(jié)蛋白 焦油 尼古丁 瑞舒伐他汀 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 原子力顯微鏡 單分子力譜 凝血酶
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中文摘要5-11
• 英文摘要11-19
• 英文縮寫19-20
• 引言20-22
• 第一部分 焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響22-47
• 前言22
• 材料與方法22-28
• 結(jié)果28-30
• 附圖30-40
• 附表40-42
• 討論42-43
• 小結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 第二部分 瑞舒伐他汀干預(yù)焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白 表達(dá)及活性的影響47-66
• 前言47
• 材料與方法47-50
• 結(jié)果50-52
• 附圖52-60
• 附表60-62
• 討論62-63
• 小結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-66
• 第三部分 單分子力譜檢測(cè)焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶 相互作用的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)66-88
• 前言66
• 材料與方法66-70
• 結(jié)果70-72
• 附圖72-82
• 附表82-84
• 討論84-86
• 小結(jié)86
• 參考文獻(xiàn)86-88
• 結(jié)論88-89
• 綜述 吸煙、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化89-96
• 參考文獻(xiàn)92-96
• 致謝96-97
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷97

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 ;The effect of cigarette smoke extract on thrombomodulinthrombin binding: an atomic force microscopy study[J];Science China(Life Sciences);2012年10期

2 徐永春;師曉麗;方曉紅;;原子力顯微鏡單分子力譜研究生物分子間相互作用[J];生命科學(xué);2008年01期

3 李慶憲;查文菁;;他汀類藥物非調(diào)脂作用的研究新進(jìn)展[J];中國醫(yī)院藥學(xué)雜志;2009年17期

  本文關(guān)鍵詞：煙草中焦油與尼古丁對(duì)血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)和血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶相互作用的影響及瑞舒伐他汀的干預(yù)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：284241