發(fā)布時間：2017-03-26 12:01

  本文關鍵詞：RGD介導多西他賽pH敏感脂質體的合成、制備、表征及體內外抗腫瘤活性評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多西他賽(Docetaxel, DTX),半合成紫杉醇類似物,是臨床上廣泛應用于乳腺癌、胰腺癌、晚期卵巢癌、、非小細胞肺癌等惡性腫瘤治療的一線藥物；通過加強微管蛋白聚集,使得細胞有絲分裂停留于G2/M期而凋亡；多西他賽,脂溶性大于水溶性,水中溶解量較低、體內非特異性分布等特點,臨床應用中出現(xiàn)生物利用度比較低現(xiàn)象,明顯削弱藥物的臨床抗腫瘤作用。臨床中采用制劑為“多帕菲(?)”和“泰索帝(?)”注射液,處方中均含有大量Tween-80和乙醇用以增溶,其中輔料Tween-80易引起超敏反應、神經(jīng)毒性、腎毒性等嚴重副反應。因此,設計和制備高靶向性新型藥物傳輸體系,是目前亟待攻克的難題。脂質體具有良好相容性、緩控釋及靶向性、長循環(huán)等優(yōu)點,是最具潛力的新型藥物、蛋白、基因等的遞送系統(tǒng)之一；脂質體制備過程中加入pH敏感材料亞油酸(LA),進入腫瘤酸性微環(huán)境后,脂質雙層膜不穩(wěn)定破裂,迅速釋放內容物；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列簡寫RGD,與整合素有較強特異性親和力,尤其是αvβ3,近幾年作為一種靶向因子得到廣泛關注。本文首次合成RGD-PEG-LA,通過PEG鏈段的“架橋作用”將靶向因子RGD修飾在制劑表面；成功制備RGD介導的載多西他賽pH敏感脂質體(RGD/DTX-PSL),并考察其藥劑學和生物學特性,研討其抗腫瘤治療的應用前景。本文主要研究內容如下：1 DTX-PSL的制備及理化性質考察本部分建立了HPLC法精確測定DTX體外含量。采用經(jīng)典薄膜分散法制備,磷脂酰乙醇胺(PE)、膽固醇(CHOL)為主體組成物質,LA為pH敏感物質,包載模型藥物DTX；主要考察制劑包封率高低,通過單因素實驗和正交優(yōu)化實驗,獲得DTX-PSL的最適宜處方組成和成熟制備工藝。同時對DTX-PSL制劑理化性質進行考察,包括平均粒徑和粒徑分布、Zeta電勢、透射電鏡(TEM)、載藥量(DL%)和包封率(EE%)等指標的測定。測得DTX-PSL制劑的DL%為4.8±0.1%,EE%為81.9±2.2%；動態(tài)光散射法測得平均粒徑及粒徑分布為127.2±3.58 nm, PDI為0.218±0.15, Zeta電勢為-35.19±1.27mV；TEM照片可觀察制劑外觀：圓形或類圓形,均一,表面完整光滑。2 RGD-PEG-LA分子的合成及RGD/DTX-PSL的制備采用固相合成法(FMOC-SPSS),按次序加入芴甲氧羰基N端占位修飾的分子,最終制備得到RGD-PEG-LA分子,并通過電噴霧質譜和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜對結構進行鑒定；DTX-PSL最優(yōu)處方中加入適量RGD-PEG-LA分子,薄膜分散法制得RGD/DTX-PSL,同樣方法考察制劑平均粒徑、Zeta電勢、透射電鏡照片,并表征DL%和EE%等；采用透析袋法,以多帕菲⑧為對照組,分別考察DTX-PSL和RGD/DTX-PSL在pH5.0、pH7.4含0.5% Tween-80磷酸鹽釋放介質中的釋放行為。ESI-MS中最高峰M=347.1是RGD分子離子峰,說明RGD合成正確無誤；分析RGD-PEG-NH2和RGD-PEG-LA分子MALDI-TOF-MS圖譜,顯示在理論分子量2383Da和2645Da處峰位較高,說明已獲得目標分子RGD-PEG-LA。測得RGD/DTX-PSL制劑的DL%為4.3±0.2%,EE%為78.4+1.7%；動態(tài)光散射法測得平均粒徑及粒徑分布為146.4±4.38 nm, PDI為0.169±0.13, Zeta電勢為-31.82±0.92mV；透射電鏡照片中制劑成型完整,均勻如一。體外釋放結果可知,與多帕菲(?)對照組相比,DTX-PSL和RGD/DTX-PSL制劑釋放時間明顯延長,具有較好緩釋性；另外,DTX-PSL和RGD/DTX-PSL在pH5.0釋放介質中較pH7.4介質釋放速度快,且有明顯突釋現(xiàn)象,顯示制劑具有一定pH敏感性；DTX-PSL和RGD/DTX-PSL制劑在不同pH環(huán)境中釋放趨勢相同,可知RGD靶向因子的存在并沒改變脂質體的體外釋放特性。3 DTX-PSL和RGD/DTX-PSL的體內、外抗腫瘤實驗采用MTT法研究Duopafei(?), DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制劑對人乳腺癌MCF-7細胞的毒性作用；載香豆素-6脂質體(C6-PSL和RGD/C6-PSL)與MCF-7孵育后,倒置熒光顯微鏡定性查看熒光強度并拍照,流式細胞儀定量測定熒光攝取情況。荷瘤Balb/c-Nu尾靜脈注射NBD-PSL、RGD/NBD-PSL制劑,共聚焦顯微鏡觀察腫瘤切片中熒光強度；抑瘤率實驗中測定鼠體重、腫瘤體積、剝離瘤塊重量,考察制劑體內抗腫瘤活性。MTT實驗中Duopafei(?)、DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制劑與MCF-7作用不同時間,能殺死一半細胞的藥物濃度(IC50)分別為24 h：6.81+0.53、4.43+0.15、2.44+0.49,48 h：5.06+0.33、2.47q0.20、1.28±0.23,72 h：1.84±0.10、1.50±0.13、1.05+0.04。細胞攝取和腫瘤切片實驗顯示：兩制劑組熒光強度遠高于游離熒光材料組,且RGD/DTX-PSL組熒光強度高于未修飾脂質體組。抑瘤率實驗中瘤體積大小為：生理鹽水組Duopafei(?)DTX-PSLRGD/DTX-PSL。以上結果,說明本實驗制備的靶向脂質體體內、外抗腫瘤效果良好。4 DTX-PSL和RGD/DTX-PSL大鼠體內藥動學研究本實驗以SD大鼠為實驗動物,分別尾靜脈注射Duopafei(?)、 DTX-PSL RGD/DTX-PSL制劑,按預設時間點頸靜脈竇取血,液液萃取法處理血樣,加入紫杉醇作為內標物,HPLC法測定血液中藥物濃度,并利用DAS2.0處理得統(tǒng)計矩參數(shù)。DTX-PSL、 RGD/DTX-PSL制劑AUCo-∞(25.363,38.081)值均大于Duopafei(?)組AUC0-∝值(10.703),而CLz值(0.513,0.341)遠小于Duopafei(?)組CLz(1.215),說明在相同時間點DTX-PSL、RGD/DTX-PSL組大鼠體內藥濃度均高于Duopafei(?)組。另外,DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制劑t1/2z(2.455,3.478)分別為Duopafei(?)組t1/2z(1.187)的2倍、3倍,可知DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制劑能夠明顯延長藥物在血液中的存留時間。綜上所述,本文通過合成RGD-PEG-LA分子,將RGD分子修飾于pH敏感脂質體表面,制備工藝簡單,粒徑均勻,外觀良好,極大提高多西他賽溶解度；通過pH敏感物理化學靶向及RGD主動靶向的聯(lián)合作用,促使載藥制劑準確的輸送至腫瘤部位,減少正常組織中藥物分布,大大減少多西他賽毒性,增強抗腫瘤療效,為進一步發(fā)展安全、穩(wěn)定、高效的藥物運輸體系提出了新思路。本論文由國家自然科學基金(No.21203112)支持完成。
【關鍵詞】：多西他賽 脂質體 pH敏感 RGD 腫瘤治療
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R943
【目錄】：

• 中文摘要20-24
• ABSTRACT24-27
• 符號說明27-30
• 前言30-37
• 第一章 載多西他賽pH敏感脂質體的藥物含量測定37-50
• 一、儀器與試劑37-38
• 1. 儀器37
• 2. 藥品與試劑37-38
• 二、實驗方法38-41
• 1. 多西他賽抗腫瘤藥物體外含量的測定38-39
• 1.1 檢測波長的確定38
• 1.2 色譜條件38
• 1.3 標準曲線的繪制38
• 1.3.1 貯備液的配制38
• 1.3.2 標準曲線的建立38
• 1.4 專屬性實驗38-39
• 1.5 定量限及檢測限的考察39
• 1.6 精密度實驗39
• 1.7 回收率實驗39
• 1.8 重現(xiàn)性實驗39
• 2. 包封率檢測方法的建立39-41
• 2.1 方法回收率40
• 2.2 加樣回收率40-41
• 三、實驗結果41-49
• 1. 多西他賽抗腫瘤藥物體外含量的測定結果41-47
• 1.1 檢測波長的確定41
• 1.2 色譜條件41-42
• 1.3 標準曲線的繪制42-43
• 1.4 專屬性實驗結果43
• 1.5 定量限及檢測限的測定結果43-44
• 1.6 精密度實驗結果44-45
• 1.7 回收率實驗結果45-46
• 1.8 重現(xiàn)性實驗結果46-47
• 2. 包封率檢測方法考察結果47-49
• 2.1 方法回收率結果47-48
• 2.2 加樣回收率結果48-49
• 四、本章小結49-50
• 第二章 多西他賽pH敏感脂質體的研究50-65
• 一、儀器與試劑50-51
• 1. 儀器50
• 2. 藥品與試劑50-51
• 二、實驗方法51-54
• 1. 制備多西他賽pH敏感型脂質體的方法考察51-52
• 1.1 乙醚注入法51
• 1.2 薄膜水化法51
• 1.3 凍融法51-52
• 2. 單因素考察52-53
• 2.1 藥脂比52
• 2.2 膽固醇的量52
• 2.3 亞油酸的量52
• 2.4 水化溫度52
• 2.5 水化時間52
• 2.6 水化體積52-53
• 3. 正交實驗法優(yōu)化制劑處方組成和制備工藝53
• 4. 三批樣品重現(xiàn)性53
• 5. 多西他賽pH敏感型脂質體理化性質的表征53-54
• 5.1 外觀形態(tài)的觀察53
• 5.2 粒徑分布及Zeta電勢的測定53-54
• 三、實驗結果54-63
• 1. 制備方法考察結果54-55
• 2. 單因素考察結果55-61
• 2.1 藥脂比55-56
• 2.2 膽固醇的量56-57
• 2.3 油酸的量57-58
• 2.4 水化溫度58-59
• 2.5 水化時間59-60
• 2.6 水化體積60-61
• 3. 正交設計實驗結果61-62
• 4. 重現(xiàn)性考察結果62
• 5. 多西他賽pH敏感型脂質體性質表征結果62-63
• 5.1 外觀形態(tài)62-63
• 5.2 粒徑分布和Zeta電勢測定結果63
• 四、本章小結63-65
• 第三章 RGD介導的載多西他賽pH敏感脂質體的研究65-87
• 一、儀器與試劑65-66
• 1 儀器65
• 2. 藥品與試劑65-66
• 二、實驗方法66-71
• 1. RGD-PEG-LA的合成及表征66-69
• 1.1 RGD靶向因子的合成66-67
• 1.1.1 樹脂溶脹活化66
• 1.1.2 天冬氨酸的連接66
• 1.1.3 脫保護(Fmoc)66
• 1.1.4 Kaiser檢測66-67
• 1.1.5 甘氨酸的縮合67
• 1.1.6 精氨酸的縮合67
• 1.1.7 切割產(chǎn)物67
• 1.2 RGD-PEG的合成67-68
• 1.3 RGD-PEG-LA的合成68-69
• 2. 制備RGD修飾的主動靶向pH敏感型脂質體69
• 3. RGD介導的載DTX pH敏感型脂質體理化性質的表征69-70
• 3.1 外觀形態(tài)的觀察69
• 3.2 粒徑分布及Zeta電勢的測定69-70
• 4. 多西他賽體外釋放實驗HPLC方法的考察70-71
• 4.1 色譜條件70
• 4.2 不同pH緩沖液的配制70
• 4.3 精密度實驗70
• 4.4 回收率實驗70
• 4.5 不同pH緩沖液中標準曲線的繪制70-71
• 4.6 多帕菲(?)、DTX-PSL和RGD/DTX-PSL的體外釋放71
• 4.6.1 多帕菲(?)的體外釋放71
• 4.6.2 DTX-PSL、RGD/DTX-PSL的體外釋放71
• 三、實驗結果71-86
• 1. RGD-PEG-LA的合成及表征71-73
• 2. 制備RGD修飾的主動靶向pH敏感型脂質體73-74
• 3. RGD介導的載DTX pH敏感型脂質體理化性質74-75
• 3.1 外觀形態(tài)74
• 3.2 粒徑分布及Zeta電勢74-75
• 4. 多西他賽體外釋放實驗HPLC方法的確立75-86
• 4.1 色譜條件75-76
• 4.2 精密度實驗76-78
• 4.3 回收率實驗78-80
• 4.4 不同pH緩沖液中標準曲線的繪制80-82
• 4.5 多帕菲(?)、DTX-PSL、RGD/DTX-PSL的體外釋放82-86
• 4.5.1 多帕菲(?)的體外釋放結果82-83
• 4.5.2 DTX-PSL、RGD/DTX-PSL的體外釋放83-86
• 四、本章小結86-87
• 第四章 多西他賽pH敏感脂質體體內、外抗腫瘤效果研究87-103
• 一、儀器與試劑87-88
• 1. 儀器87
• 2. 藥品與試劑87
• 3. 實驗動物87-88
• 二、實驗方法88-93
• 1. 細胞培養(yǎng)及腫瘤移植88-89
• 1.1 細胞復蘇88
• 1.2 細胞換液與培養(yǎng)88
• 1.3 細胞計數(shù)與接種88-89
• 1.4 細胞凍存89
• 1.5 人乳腺癌模型的制作89
• 2. 細胞毒性實驗89-91
• 2.1 空白脂質體對MCF-7細胞毒性實驗90
• 2.2 多帕菲(?)、載藥脂質體對MCF-7細胞毒性實驗90-91
• 3. 細胞攝取實驗91-92
• 3.1 定性細胞攝取實驗91
• 3.2 定量細胞攝取實驗91-92
• 4. 體內腫瘤靶向性實驗92-93
• 4.1 NBD標記熒光切片實驗92
• 4.2 熒光組織切片實驗92-93
• 5. 抑瘤率實驗93
• 三、實驗結果93-101
• 1. 細胞毒性實驗93-97
• 1.1 空白脂質體對MCF-7細胞毒性實驗93-94
• 1.2 Duopafei(?)、載藥脂質體對MCF-7細胞毒性實驗94-97
• 2. 細胞攝取實驗97-99
• 3. 熒光組織切片實驗99-100
• 4. 抑瘤率實驗100-101
• 四、本章小結101-103
• 第五章 多西他賽pH敏感脂質體的體內藥動學研究103-116
• 一、儀器與試劑103
• 1. 儀器103
• 2. 藥品與試劑103
• 3. 動物103
• 二、實驗方法103-107
• 1. 血漿樣品處理方法的建立103-104
• 2. 血漿樣品測定方法的建立104-106
• 2.1 色譜條件104
• 2.2 方法專屬性實驗104
• 2.3 精密度實驗104
• 2.4 方法提取回收率104-105
• 2.5 測定方法回收率105
• 2.6 標準曲線的建立105-106
• 2.6.1 溶液的配制105
• 2.6.2 標準曲線的繪制105-106
• 3. 多西他賽及制劑大鼠體內的藥物動力學評價106-107
• 3.1 實驗方法106
• 3.2 血藥濃度的測定106
• 3.3 藥代動力學參數(shù)的計算106-107
• 三、實驗結果107-115
• 1. 血漿樣品測定方法107-112
• 1.1 方法專屬性107-108
• 1.2 精密度結果108-109
• 1.3 方法提取回收率109-110
• 1.4 測定方法回收率110-111
• 1.5 標準曲線繪制結果111-112
• 2. 多西他賽及制劑大鼠體內的藥物動力學評價112-115
• 2.1 血藥濃度測定結果112-113
• 2.2 藥代動力學參數(shù)113-115
• 四、本章小結115-116
• 總結與展望116-119
• 參考文獻119-127
• 致謝127-128
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文128-129
• 附件129

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8 張新科;左氧氟沙星脂質體的肺靶向性研究[D];山東大學;2009年

9 楊占嫻;異煙肼磷脂前體藥物脂質體的制備和性質研究[D];西北大學;2010年

10 楊雯姝;注射用重酒石酸長春瑞濱脂質體的制劑學研究[D];沈陽藥科大學;2005年

  本文關鍵詞：RGD介導多西他賽pH敏感脂質體的合成、制備、表征及體內外抗腫瘤活性評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：268746