本文關(guān)鍵詞：白蛋白納米粒的胞吞作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 納米給藥系統(tǒng)若要發(fā)揮療效,不僅要在靶部位濃集,還需保證將藥物遞送到胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)。雖然避免調(diào)理素和脂蛋白的作用及被巨噬細(xì)胞吞噬是藥物靶向的重要條件,但是如果納米給藥系統(tǒng)不能以合理的方式到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的靶部位,并且有效釋放藥物,同樣不能發(fā)揮很好的療效。 靶向納米顆粒到達(dá)靶組織/靶器官后可在胞外釋放藥物,使藥物以游離方式入胞或攜帶藥物直接進(jìn)入細(xì)胞,在胞內(nèi)靶點(diǎn)適時(shí)地釋放藥物。前一種傳遞方式的關(guān)鍵在于給藥系統(tǒng)的釋放藥物特性,胞外藥物釋放行為決定了最終的藥效發(fā)揮。而后者給藥系統(tǒng)的入胞過(guò)程涉及入胞方式、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、藥物的胞內(nèi)釋放、細(xì)胞外排等復(fù)雜的細(xì)胞處置過(guò)程,也是藥劑學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注且極具挑戰(zhàn)的研究?jī)?nèi)容。 大多細(xì)胞主要以內(nèi)吞的方式對(duì)外源性納米粒子進(jìn)行攝取,而內(nèi)吞主要分為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(clathrin-mediated endocytosis)、細(xì)胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)的內(nèi)吞(caveolae-mediated endocytosis)、大胞飲和非網(wǎng)格蛋白-細(xì)胞膜穴樣凹陷依賴的4種內(nèi)吞。而幾年來(lái)備受關(guān)注的細(xì)胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)的內(nèi)吞是將載體遞送至pH條件和生物條件緩和的小窩體(caveosome)內(nèi)然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和胞漿中,避免了經(jīng)典的內(nèi)體／溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)體系。以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞最為常見(jiàn)。納米顆粒入胞后進(jìn)入內(nèi)體,進(jìn)一步與溶酶體融合,這對(duì)非溶酶體靶向的藥物不利。微粒種類、表面電荷、物化性質(zhì)等因素都會(huì)影響甚至改變細(xì)胞的內(nèi)吞途徑,改變納米給藥系統(tǒng)在胞內(nèi)的分布和在溶酶體中的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,從而影響胞內(nèi)靶點(diǎn)處的藥物濃度。同時(shí),細(xì)胞內(nèi)吞效率、細(xì)胞消除、胞內(nèi)藥物釋放也受載體因素的影響。 結(jié)合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們將鈣黃綠素作為水溶性小分子藥物模型,制備了鈣黃綠素白蛋白納米粒,考察了納米粒包裹對(duì)其細(xì)胞攝取及內(nèi)化途徑的影響。 研究目的 制備白蛋白納米粒,并進(jìn)一步研究其胞吞機(jī)理。 研究方法 1.制備方法與表征 用去溶劑化和乳化凝聚法制備鈣黃綠素白蛋白納米粒,并確定最佳處方和工藝條件。去溶劑化：先將白蛋白加入含有藥物的稀水溶液中使之溶解,再加入有機(jī)溶劑使白蛋白脫水凝聚收縮成團(tuán)粒,最后用甲醛或戊二醛作為交聯(lián)劑固化成載藥納米粒。乳化凝聚法：①乳化。將藥物與白蛋白一起溶解或分散于水中作為水相,將其加入攪拌著的油相中使之稱為w/o型乳液。②固化。可以采用加熱固化或用化學(xué)交聯(lián)劑使白蛋白之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而固化,常用甲醛或戊二醛為化學(xué)交聯(lián)劑。③分離。將形成的納米粒加入乙醚溶解油相,離心分離,即得。 納米粒膠體溶液在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中粒子會(huì)發(fā)生聚集和沉降現(xiàn)象,并有部分藥物游離出來(lái)。因此,將納米粒制成凍干粉針以提高制劑的穩(wěn)定性。用透射電鏡對(duì)納米粒的形狀和表面形態(tài)進(jìn)行考察,并用粒徑分析儀對(duì)粒徑分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用動(dòng)態(tài)透析法做體外釋放研究。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將最佳處方的鈣黃綠素白蛋白納米粒凍干制劑于冰箱中4℃密封保存,分別于3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月和12個(gè)月測(cè)定納米粒的外觀、再分散性,考察其長(zhǎng)期穩(wěn)定性。采用經(jīng)典的MTT法檢測(cè)白蛋白納米粒的細(xì)胞毒性,注射用鹽酸阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照組。1mg·mL-1的藥物溶液與細(xì)胞孵育48h后,通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞活力考察calcein HSA-NPs的細(xì)胞毒性。 2.納米粒胞吞機(jī)理研究 本文采用多功能酶標(biāo)儀在λex=470nm,λem=509nm處檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)的細(xì)胞裂解液的熒光強(qiáng)度,激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞攝取、胞內(nèi)分布。對(duì)于細(xì)胞攝取機(jī)制的考察,細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種至6孔板上,待完全貼壁生長(zhǎng)24h后,棄去培養(yǎng)液換成含細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑疊氮鈉(NaN3),2-去氧葡萄糖(2DG),氯丙嗪(CPZ),非律平(Filipin),細(xì)胞松弛素D,蔗糖(Sucrose)的培養(yǎng)液,與細(xì)胞孵育30min后加入1mg-mL-1載鈣黃綠素的納米粒,繼續(xù)培養(yǎng)1h。然后以PBS洗滌,胰酶消化后收集細(xì)胞,PBS洗滌3次,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其平均熒光強(qiáng)度,透射電鏡觀察細(xì)胞攝取的超薄切片。最后我們用熒光顯微鏡觀察Calcein HSA-NPs對(duì)細(xì)胞F-Actin蛋白的影響。 研究結(jié)果 1.制備方法與表征 采用去溶劑化法制備鈣黃綠素白蛋白納米粒,最佳制備處方和工藝為：白蛋白溶液的濃度為1%,鈣黃綠素溶液濃度為1mg-mL-1,加入緩沖液的pH值為9,攪拌速度為700rpm,固化時(shí)間為12h。離心轉(zhuǎn)速為15000r-min-1,30min,納米粒凍干后產(chǎn)品外觀較好,色澤均勻,易于保存。遇水振搖片刻即分散均勻,光子相關(guān)光譜儀測(cè)得平均粒徑為204.8nm,多聚分散度為0.164, zeta電位為-29.6mV。大部分粒子分布在100-300nm范圍內(nèi)。透射電鏡觀察納米粒為圓球形,表面光滑。體外釋放結(jié)果顯示鈣黃綠素白蛋白納米粒有較好的緩釋作用,96h時(shí)釋放不到80%,而鈣黃綠素溶液在10h左右釋放完全�？梢员ＷC后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中藥物不從或僅少量從納米粒中釋放,避免游離藥物攝取而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示,白蛋白納米粒在4℃冰箱密封保存1年外觀、重分散性和粒徑?jīng)]有變化,因此該制劑在低溫環(huán)境中穩(wěn)定性良好。細(xì)胞毒性結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比,白蛋白納米粒和鈣黃綠素白蛋白納米粒對(duì)細(xì)胞的活力無(wú)影響,阿霉素溶液的細(xì)胞毒性較顯著。納米粒對(duì)HepG2、L02、 HUVEC、A549細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有影響。 2.納米粒胞吞機(jī)理研究 細(xì)胞攝取半定量實(shí)驗(yàn)表明,細(xì)胞攝取的納米粒熒光強(qiáng)度隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,4h細(xì)胞攝取calcein HSA-NPs最多。對(duì)于細(xì)胞攝取定性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)納米粒孵育時(shí)間在0.5h、1.5h,細(xì)胞中的綠色熒光信號(hào)很少,可以看出隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng),納米粒越來(lái)越向細(xì)胞核緊密靠近,4h發(fā)現(xiàn)納米粒成簇分布在細(xì)胞核周圍,10h納米粒在細(xì)胞核周圍緊密分布。而HepG2、L02、HUVEC、A549對(duì)其攝取隨時(shí)間的變化納米粒在細(xì)胞核聚集明顯。細(xì)胞消除實(shí)驗(yàn),消除4h內(nèi),納米粒一直在細(xì)胞核周圍。 本實(shí)驗(yàn)采用低溫和能量代謝抑制劑2DG和NaN3研究鈣黃綠素的胞內(nèi)聚集情況。結(jié)果顯示兩種情況下,鈣黃綠素?cái)z取均顯著低于對(duì)照組(P均0.05)。表明calcein HSA-NPs是通過(guò)內(nèi)吞方式入胞的。2DG/NaN3、CD、CPZ和Sucrose均能顯著抑制L02對(duì)calcein HSA-NPs的攝取,其抑制率分別為68.59%、69.65%、71.73%、67.81%。Filipin對(duì)細(xì)胞的攝取無(wú)顯著影響。 納米粒對(duì)細(xì)胞F-actin蛋白的影響,將細(xì)胞單層與白蛋白納米粒共同孵育2h、4h后的掃描圖,與對(duì)照組相比,熒光強(qiáng)度明顯減弱,胞質(zhì)的熒光已無(wú)法識(shí)別,并且F-actin蛋白大都解聚形成松散的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)。組成膜骨架的環(huán)繞在各個(gè)緊密連接的細(xì)胞周圍的"F-actin環(huán)”的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 研究結(jié)論 用去溶劑化法將鈣黃綠素作為水溶性小分子藥物模型,制備的鈣黃綠素白蛋白納米粒粒徑較小,形態(tài)圓整,大小較均勻。白蛋白納米粒的胞吞作用呈現(xiàn)時(shí)間、濃度、溫度依賴性,均為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,其可以顯著提高跨膜能力差的水溶性小分子鈣黃綠素的入胞能力。Calcein HSA-NPs主要是經(jīng)clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和大胞飲入胞的,內(nèi)化后主要集中在溶酶體內(nèi)。白蛋白納米粒的作用使細(xì)胞F-actin蛋白大都解聚形成松散的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu),影響了細(xì)胞之間的緊密連接。
【關(guān)鍵詞】：白蛋白納米粒 內(nèi)吞抑制 胞吞機(jī)理
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R943
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 目錄14-16
• 第一章 前言16-30
• 1 納米粒給藥系統(tǒng)的作用特點(diǎn)17-18
• 2 納米載體入胞的方式和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程18-22
• 3 結(jié)語(yǔ)22-23
• 參考文獻(xiàn)23-30
• 第二章 鈣黃綠素白蛋白納米粒的制備和表征30-50
• 1 材料與儀器32-34
• 2 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 3 結(jié)果37-46
• 4 討論46-48
• 5 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-50
• 第三章 細(xì)胞對(duì)白蛋白納米粒的攝取機(jī)理50-73
• 1 材料與儀器50-52
• 2 實(shí)驗(yàn)方法52-55
• 3 結(jié)果55-68
• 4 討論68-71
• 5 結(jié)論71
• 參考文獻(xiàn)71-73
• 全文小結(jié)73-76
• 中英文縮略詞表76-77
• 研究生期間發(fā)表和撰寫(xiě)論文77-78
• 致謝78-80
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明80

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本文編號(hào)：260747