本文關(guān)鍵詞：人和鼠肝微粒體藥物代謝檢測平臺的建立及初步應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】： 肝臟是人體重要的生物轉(zhuǎn)化場所,肝細胞的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(sER)上鑲嵌著豐富的代謝酶,負責內(nèi)源及外源化合物的代謝。這其中包括主要的Ⅰ相藥物代謝酶:細胞色素P450(CYP)及黃素單氧化酶(FMO)。破碎肝細胞后,制備人肝臟微粒體(HLM),其上保留著這些酶。因此HLM可以用來進行體外的藥物代謝研究,包括ⅰ).CYP反應(yīng)表型研究;ⅱ).基于CYP的藥物相互作用研究,以及代謝穩(wěn)定性的研究。藥物代謝的體外和體內(nèi)研究數(shù)據(jù)有一定的相關(guān)性,體外研究有助于解釋臨床數(shù)據(jù),可用于評價藥物在人體內(nèi)潛在的代謝情況。采用體外研究早期發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)藥物代謝的途徑和產(chǎn)物,可以為臨床前研究提供明確的方向。本研究的目的是建立體外藥物代謝研究用的人和鼠肝微粒體藥物代謝模型,并對其應(yīng)用進行初探。 首先用改良后的Omura法,制備SD大鼠和混合人肝微粒體。制備好的人、鼠肝微粒體經(jīng)一氧化碳還原示差法對P450酶含量進行測定。之后用熒光檢測技術(shù)檢測肝微粒體對熒光底物CEC、DBF、AMMC和EFC的代謝情況,初步判斷肝微粒是否具有P450酶催化活性。定量結(jié)果顯示制備的人、鼠肝微粒體在450nm有明顯的吸收峰,測得P450酶含量分別為593±27pmol/mg和964.67±32pmol/mg。通過與四種熒光底物進行多次酶活性檢測。除了EFC底物無明顯催化活性,人肝微粒體對AMMC的催化活性較弱外,人肝和鼠肝微粒體均可以與CEC、DBF底物作用,呈現(xiàn)出明顯而穩(wěn)定的催化活性,在一定范圍內(nèi)熒光信號隨著酶濃度增大而增大,隨著時間的延長而增強。 其次用高效液相色譜技術(shù)進一步評價肝微粒體藥物代謝檢測平臺的可靠性,將肝微粒體與特異性探針底物bufuralol、coumarin、s-mephenytoin和nifedipine反應(yīng),分析生成的產(chǎn)物,計算K_m、V_(max)值,根據(jù)CL_(int)=V_(max)/K_m計算內(nèi)在清除率。同時用2D6、2A6、2C19和3A4特異性抑制劑奎寧丁、反苯環(huán)丙胺及酮康唑?qū)θ�、鼠肝微粒體進行抑制實驗,察看抑制效應(yīng)強弱,求解IC_(50)值。結(jié)果顯示:鼠肝微粒體對探針底物bufuralol和nifedipine有顯著的催化活性,而對coumarin和s-mephenytoin無代謝;人肝微粒體則對四種特異性探針底物均有明顯而穩(wěn)定的催化活性,所求得的K_m、V_(max)和CL_(int)值也與文獻報道的相符。特異性抑制劑對鼠肝微粒體均無抑制效應(yīng),而對人肝微粒體則顯示出了較強的抑制效應(yīng),IC_(50)值較小。 通過多方面的比較,證明了本研究建立的人、鼠肝微粒體體外藥物代謝平臺的可行性和可靠性。熒光檢測和高效液相色譜檢測結(jié)果表現(xiàn)出一致性�；钚詼y定結(jié)果和抑制作用檢測結(jié)果表明了人、鼠肝微粒體可用于CYP450酶及其相關(guān)藥物代謝研究的體外模型,使實驗結(jié)果相互驗證。在人肝微粒體與重組人細胞色素P450酶比較中,證明了采用酶反應(yīng)活性測定及其選擇性抑制作用測定的結(jié)合模式具有科學性�？傊狙芯砍晒⒘巳�、鼠肝微粒體藥物代謝檢測平臺,并對其應(yīng)用進行了初探。
【關(guān)鍵詞】：人肝微粒體 鼠肝微粒體 細胞色素P450 酶動力學分析 熒光檢測技術(shù) 高效液相色譜檢測技術(shù)
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 英文縮略語表11-12
• 前言12-14
• 第一章 文獻回顧14-29
• 1 藥物代謝的研究進展14-19
• 1.1 藥物代謝的過程及研究進展14-15
• 1.2 藥物代謝的場所15
• 1.3 藥物代謝酶系統(tǒng)15-16
• 1.4 影響藥物代謝的因素16-19
• 1.4.1 種屬差異16-17
• 1.4.2 個體差異17-18
• 1.4.3 藥物相互作用18-19
• 2 人肝細胞色素P450及其在藥物代謝中作用的研究進展19-27
• 2.1 CYP450的命名與分布19-20
• 2.2 CYP450在藥物代謝中的作用及其功能成份20-21
• 2.3 CYP450酶的遺傳多態(tài)性21-22
• 2.4 與CYP450有關(guān)的體外藥物代謝研究方法進展22-25
• 2.4.1 肝微粒體體外代謝法22-23
• 2.4.1.1 肝微粒體的用途22-23
• 2.4.1.2 肝微粒的模型特點23
• 2.4.2 肝細胞體外代謝法23-24
• 2.4.3 肝切片法24
• 2.4.4 離體肝灌流法24
• 2.4.5 重組CYP450酶24-25
• 2.5 與CYP450有關(guān)的藥物代謝檢測方法進展25-26
• 2.5.1 色譜檢測技術(shù)25-26
• 2.5.2 放射性檢測技術(shù)26
• 2.5.3 熒光檢測技術(shù)26
• 2.5.4 生物發(fā)光檢測技術(shù)26
• 2.6 CYP450藥物代謝系統(tǒng)的評價方法26-27
• 2.6.1 代謝穩(wěn)定性評價方法26-27
• 2.6.2 CYP450酶抑制的評價方法27
• 2.6.3 CYP450酶誘導的評價方法27
• 3 CYP450藥物代謝研究的展望27-29
• 第二章 大鼠和人肝微粒體藥物代謝檢測平臺的建立及初步評價29-41
• 1 材料29-31
• 1.1 肝組織材料29
• 1.1.1 大鼠肝組織材料29
• 1.1.2 人肝組織材料29
• 1.2 試劑29-30
• 1.3 主要溶液30
• 1.4 主要儀器30-31
• 2 方法31-33
• 2.1 鼠肝微粒體的制備及鑒定31-32
• 2.1.1 樣品的處理31
• 2.1.2 肝微粒體的制備31
• 2.1.3 肝微粒體濃度的測定31
• 2.1.4 肝微粒體中P450含量的測定31-32
• 2.1.5 肝微粒體制備條件的優(yōu)化32
• 2.1.6 熒光檢測技術(shù)測定大鼠肝微粒體中P450酶活性32
• 2.2 人肝微粒體的制備及鑒定32-33
• 2.2.1 肝臟的采集32-33
• 2.2.2 樣品的處理33
• 2.2.3 肝微粒體的制備33
• 2.2.4 肝微粒體濃度的測定33
• 2.2.5 肝微粒體中P450含量的測定33
• 2.2.6 熒光檢測技術(shù)測定人肝微粒體中P450酶活性33
• 3 結(jié)果33-37
• 3.1 大鼠肝微粒的制備及測定結(jié)果33-36
• 3.1.1 BSA標準曲線繪制33-34
• 3.1.2 鼠肝微粒體中P450含量的測定34-35
• 3.1.3 熒光檢測技術(shù)測定鼠肝微粒體中P450酶活性35-36
• 3.2 人肝微粒的制備及測定結(jié)果36-37
• 3.2.1 BSA標準曲線繪制36
• 3.2.2 人肝微粒體中P450含量的測定36-37
• 3.2.3 熒光檢測技術(shù)測定鼠肝微粒體中P450酶活性37
• 4 討論37-41
• 4.1 肝微粒體模型的建立38-39
• 4.2 肝微粒體模型的初步評價39-41
• 4.2.1 P450酶含量的測定39-40
• 4.2.2 P450活性的初步檢測40-41
• 第三章 HPLC檢測技術(shù)鑒定人、鼠肝微粒體藥物代謝檢測平臺及其應(yīng)用研究的初探41-58
• 1 材料41-42
• 1.1 肝微粒體41
• 1.2 主要試劑41-42
• 1.3 主要溶液42
• 1.4 主要儀器42
• 2 方法42-49
• 2.1 高效液相色譜技術(shù)測定大鼠肝微粒體中P450酶活性42-46
• 2.1.1 用Bufuralol(2D6底物)測定鼠肝微粒體中2D6酶活性42-44
• 2.1.2 用Coumarin(2A6底物)測定鼠肝微粒體中2A6酶活性44-45
• 2.1.3 用S-Mephenytoin(2C19底物)測定鼠肝微粒體中2C19酶活性45
• 2.1.4 用Nifedipine(3A4底物)測定鼠肝微粒體中3A4酶活性45-46
• 2.2.高效液相色譜技術(shù)測定人肝微粒體中P450酶活性46-49
• 2.2.1 用Bufuralol(2D6底物)測定人肝微粒體中2D6酶活性46-47
• 2.2.2 用Coumarin(2A6底物)測定人肝微粒體中2A6酶活性47-48
• 2.2.3 用S-Mephenytoin(2C19底物)測定人肝微粒體中2C19酶活性48-49
• 2.2.4 用Nifedipine(3A4底物)測定人肝微粒體中3A4酶活性49
• 3 結(jié)果49-54
• 3.1 各探針底物標準曲線的建立49-50
• 3.2 鼠肝微粒體與各底物反應(yīng)時間和酶濃度的優(yōu)化50
• 3.3 人肝微粒體與各底物反應(yīng)時間和酶濃度的優(yōu)化50-51
• 3.4 鼠肝微粒體與各底物反應(yīng)酶動力學參數(shù)的計算51
• 3.5 人肝微粒體與各底物反應(yīng)酶動力學參數(shù)的計算51-52
• 3.6 各特異性抑制劑對鼠肝微粒體的抑制及IC_(50)52-53
• 3.7 各特異性抑制劑對人肝微粒體的抑制及IC_(50)53-54
• 4 討論54-58
• 4.1 HPLC與熒光檢測方法的比較54
• 4.1.1 色譜檢測技術(shù)與熒光檢測技術(shù)的比較54
• 4.1.2 色譜檢測與熒光檢測結(jié)果的比較54
• 4.2 HLM和RLM藥物代謝模型的比較54-56
• 4.2.1 酶動力學參數(shù)的比較55
• 4.2.2 抑制效應(yīng)(IC_(50))的比較55-56
• 4.3 HLM和重組P450酶藥物代謝模型的比較56-57
• 4.3.1 酶動力學參數(shù)的比較56-57
• 4.3.2 抑制效應(yīng)(IC_(50))的比較57
• 4.4 實驗數(shù)據(jù)與報道文獻的比較57
• 4.5 小結(jié)57-58
• 全文小結(jié)58-60
• 1 結(jié)論58-59
• 2 今后工作展望59-60
• 附錄60-67
• 參考文獻67-76
• 致謝76

【引證文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王芳;李艷麗;鄭文;許卉;;硝苯地平探針高效液相色譜法測定大鼠肝微粒體CYP3A酶活性[J];煙臺大學學報(自然科學與工程版);2013年02期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 李晶;沒食子酸冰片酯在肝微粒體中的代謝研究[D];西北大學;2011年

2 孫坤;青蒿素類抗瘧藥與藥物代謝酶相互作用研究[D];山西醫(yī)科大學;2011年

3 王鵬;蒙古黃芪中皂苷類成分提取工藝及其體外代謝的初步研究[D];山西醫(yī)科大學;2010年

4 唐維;白藜蘆醇在大鼠體內(nèi)的藥代動力學及其對CYP1A1酶活性的影響[D];華中科技大學;2011年

5 楊櫻;不同種屬動物肝微粒體CYP450酶對鉤吻代謝的影響[D];福建中醫(yī)藥大學;2013年

  本文關(guān)鍵詞：人和鼠肝微粒體藥物代謝檢測平臺的建立及初步應(yīng)用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：259435