本文關鍵詞：腸道細菌對阿魏酸的代謝研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

第 42 卷 2014 年 2 月

分析化學 （ FENXI HUAXUE）

研究報告

第2 期 244 ～ 248
DOI： 10． 3724 / SP． J． 1096． 2014． 30648

Chinese Journal of Analytical Chemistry
腸道細菌對阿魏酸的代謝研究
張蔚
摘 要

江曙

錢大瑋

*

尚爾鑫

管漢亮

任浩

段金廒

（ 南京中醫(yī)藥大學，江蘇省方劑高技術研究重點實驗室 ，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 ，南京 210046 ） 研究人體腸道細菌對阿魏酸的代謝 。采集健康志愿者新鮮糞便 ， 稱重稀釋后厭氧培養(yǎng)， 通過反復涂

QTOF / MS ） 與 布分離得到 69 種 人 體 腸 道 細 菌。 采 用 超 高 效 液 相 四 級 桿 飛 行 時 間 串 聯(lián) 質(zhì) 譜 技 術 （ UPLCMetabolynx TM 軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物 ， 共鑒定出了 3 種代謝產(chǎn)物， 分別是氫化產(chǎn)物、 去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物 ； 此外， 篩選出了對阿魏酸有特殊代謝活性的 2 種單菌， 其 中一種為已鑒定了的 Bacillus sp． 46 ； 而另一種未知的細菌則用 16S 核糖體 ＲNA（ 16S rＲNA） 技術進行了鑒定， 結果表明， 此細菌為 Enterococcus sp． 45 。本研究提示腸道細菌對阿魏酸有代謝作用且由不同細菌完成 。 關鍵詞 QTOF / MS ） ； 代謝產(chǎn)物； 16S 阿魏酸； 腸道細菌； 超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術 （ UPLC-

核糖體 ＲNA（ 16S rＲNA）

1

引

言

8 人腸道中大約有 100 多種總數(shù)超過 10 的細菌棲息， 其中 99% 為厭氧菌， 這些細菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細 ［1 ， 2 ］ ， 。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶， 菌群” 共同構成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 主要包括水解酶、 氧化還

原酶、 裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等

［3 ］

。口服藥物進入腸道后， 不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化， 產(chǎn)生

［4 ］ 出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物 ， 因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動中起著重要作用 。 3阿魏酸（ Ferulic acid） ， 化學名為 4羥基甲氧基苯丙烯酸， 是阿魏、 川芎、 當歸、 升麻、 木賊等多種

中藥的有效成分之一。藥理實驗表明， 阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、 抗氧化， 抗腫瘤、 抗突變、 增 ［5 ， 6 ］ ， 加免疫力等多種作用 已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一 。目前， 已有大量關于阿魏酸體內(nèi)代謝
［9 ］ ， 但有關人體腸道混合菌及單種細菌對阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報道 。 本研究 采集了健康志愿者新鮮糞便，通過反復的涂布和培養(yǎng)， 最終分離得到 69 種人體腸道細菌。采用超高效

研究的報道

［7 ， 8 ］

QTOF / MS ） 與 Metabolynx TM 軟件［10］尋找阿魏酸與人體腸道混 液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術（ UPLC并用 16S 核糖體 ＲNA 技術 （ 16S rＲNA ） 對具有特殊代謝活性的細菌進 合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物， 行了鑒定，鑒定出了對阿魏酸具有代謝活性的細菌 ， 為全面了解腸道細菌對阿魏酸的代謝提供了依據(jù) 。

2
2． 1

實驗部分

儀器與試劑 UPLC Acquity TM 系統(tǒng) （ Waters 公司 ） ； Synapt TM QTOF 質(zhì)譜儀 （ Waters 公司 ） ， 配有電噴霧離子源 TM （ ESI） ； Masslynx 4． 1 質(zhì)譜工作站軟件 （ Waters 公司 ） ； MetaboLynx 分析軟件 （ Waters 公司 ） ； MLS3750

9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（ 上海三發(fā)科學儀器有限公司） ； WD型高壓蒸汽滅菌器（ SANYO 公司） ； GNP9402A 型 PCＲ 擴增儀（ 北京六一儀器公司 ） ； DYY8C 電泳儀 （ 北京六一儀器公司 ） ； TGL16B 高速離心 80A 微型渦旋混合儀 （ 上海滬西分析儀器廠有限公司 ） ； TD2102 電子天 機（ 上海安亭科學儀器廠） ； XW平（ 賽多利斯科學儀器有限公司） ； EPED 型超純水系統(tǒng)（ 南京易普達易科技發(fā)展有限公司 ） 。 201012 ） ； PfuX7 （ DNA 聚合酶） 、 Pfu buffer（ 聚合酶 阿魏酸（ 中國藥品生物制品檢定所， 批號 110773） 、 dNTPs （ 4 ） 、 DNA DNA 鏈式反應緩沖液 種脫氧核糖核酸 提取試劑盒和 凝膠回收試劑盒 （ 上海博亞生 物技術有限公司） ； 乙腈與甲酸為色譜純， 其余試劑為分析純。
20130620 收稿； 20131012 接受 本文系江蘇省高校自然科學基金重大研究項目（ No． 10KJA360039 ） 和江蘇省方劑高技術研究重點實驗室建設項目（ No． BM2010576 ） 資助 * Email： qiandwnj@ 126． com

第2 期

張 蔚等： 腸道細菌對阿魏酸的代謝研究

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4 ℃ 中保存?zhèn)溆谩?準確稱取阿魏酸對照品適量， 用超純水超聲溶解， 配制成 2． 0 g / L 標準溶液， 2． 2 普通厭氧培養(yǎng)液（ GAM） 的配制、 滅菌 稱取胰蛋白胨 10． 00 g， 大豆蛋白胨 3． 00 g， 朊胨 10． 00 g， 酵母浸膏 5． 00 g， 血清消化粉 13． 50 g， 牛 KH2 PO4 2． 50 g， NaCl 3． 00 g， L肝浸出粉 1． 20 g， 牛肉膏 2． 20 g， 葡萄糖 3． 00 g， 可溶性淀粉 5． 00 g， 半胱 氨酸鹽 0． 30 g， 硫代乙醇酸鈉 0． 30 g， 用超純水加熱溶解， 調(diào)節(jié)至 pH 7． 2 并最終定容至 1000 mL。 準確 稱取 2． 70 g NaCl， 用超純水定容至 300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在 121℃ 的高壓蒸汽滅菌鍋中滅
［11 ］ 菌 20 min， 冷卻備用 。 2． 3 人體腸道菌液的制備及細菌的分離 、 培養(yǎng) 收集健康女性志愿者（ 受試者無腸道疾病或代謝性疾病史， 且在采樣前 3 個月內(nèi)未服用過任何抗 ） 5． 0 g ， 1∶ 4 （ g / mL ） 比例混合， 生素或益生素 的新鮮糞便 與生理鹽水按比例 渦旋 2 min 制成混懸液， 再 ［12 ］ 1000 r / min 離心 10 min 得 上 清 液， 即 為 腸 道 菌 液 。將 腸 道 菌 液 加 到 生 理 鹽 水 中 連 續(xù) 稀 釋， 吸取 0． 1 mL 適當濃度的稀釋液接種在 GAM 瓊脂平板上，均勻涂布， 并在 37 ℃ 厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和

反復平板涂布， 分離出 69 種細菌， 標號為 sp． 1 ～ sp． 69 并冷凍保存在 4℃ 冰箱中， 以便后面研究使 ［13 ］ 用 。 2． 4 含藥腸道菌液的厭氧共培養(yǎng)及細菌供試液的制備 37 ℃ 條件下厭氧培養(yǎng) 24 h， 將混合菌及各單菌分別接種在含有 1． 0 mL 厭氧培養(yǎng)液的離心管中， 即

得到細菌種子液。取出渦旋 1 min， 用生理鹽水連續(xù) 10 倍稀釋兩次， 從最終稀釋液中吸取 0． 1 mL 加到 0． 9 mL 厭氧培養(yǎng)液中（ 每份培養(yǎng)液均含 9． 7 μL 阿魏酸標準品溶液） 。每種細菌平行做 3 份， 并在 37 ℃ 厭氧條件下培養(yǎng) 48 h。同時做空白對照實驗。 48 h 后取出含藥腸道菌液， 將每種細菌的 3 份平行培養(yǎng)液合并， 以 1 ～ 1． 5 倍的乙酸乙酯反復萃取 3 次， 且 合 并 各 自 萃 取 后 的 上 清 液。 上 清 液 在 50 ℃ 烘 箱 中 烘 干， 再 用 0． 3 mL 甲 醇 超 聲 復 溶， 13000 r / min 離心 10 min 后吸取上清液， 作為細菌樣品的供試液。 2． 5 色譜質(zhì)譜條件 Acquity UPLCBEH C18 色譜柱（ 100 mm × 2． 1 mm， 1． 7 μm） ； 流動相： 乙腈 （ A） 和 0． 1% 甲酸 （ B ） ， 10% ～ 40% A； 7． 5 ～ 9 min，40% ～ 90% A； 9 ～ 10 min，90% A； 10 ～ 12 min， 梯度洗脫（ 0 ～ 7． 5 min，

10% A） ， 柱溫 35 ℃ ， 流速 0． 4 mL / min， 進樣量 5 μL。 ! ESI 模式； 毛細管電壓： 2 kV； 錐孔電壓： 40 V； 離子源溫度： 120 ℃ ； 脫溶劑氣溫度： 350 ℃ ； 錐孔氣流 量： 50 L / h； 脫溶劑氣流量： 600 L / h； 碰撞能量（ 6 ～ 40 V） ； 質(zhì)量掃描范圍： m / z 100 ～ 1000 ； 采用蘆丁溶 E 液為鎖定質(zhì)量溶液； 數(shù)據(jù)采集模式： 碰撞能量梯度（ MS ） ； 數(shù)據(jù)分析： 質(zhì)量虧損過濾 （ MDF） 。 2． 6 代謝產(chǎn)物的鑒定與分析 將阿魏酸可能的Ⅰ相代謝途徑如： 還原、 氧化、 羥化、 羥化甲基化等； 可能的 Ⅱ 相代謝途徑如： 甲基 化、 乙酰化、 磺酸化、 羥化再磺酸化、 葡糖醛酸化、 羥化再葡糖醛酸化、 磺酸化葡糖醛酸化、 雙葡糖醛酸化 等輸入 Metabolynx 軟件 Metabolite List 窗口中， 質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢測誤差范圍 ＜ 10 mDa， 軟件自動根據(jù)采集的 數(shù)據(jù)及設置的處理方法進行分析 。 有代謝活性細菌的鑒定 sp． 46 對阿魏酸具有特殊代謝能力， 經(jīng)分析，細菌 sp． 45 、 其中 sp． 46 細菌已經(jīng)鑒定為 Bacillus sp． 46 。故將另一種未知的細菌進行 16S rＲNA 鑒定。鑒定步驟如下： 首先將 sp． 45 細菌接種在培養(yǎng)液中， 2． 7 13000 r / min 離心 1 min， 厭氧培養(yǎng) 24 h 后取出，， 棄上清液后用 DNA 提取試劑盒提取細菌的 DNA。 再以 提取的細菌 DNA 為模板， 通過 PCＲ 反應擴增菌株的 16S rDNA 基因序列。擴增反應用到的通用引物為 16S1F （ 5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3' ） 和 16S1Ｒ （ 5'AGA AAG GAG GTG ATC C3' ） 。 PCＲ PfuX7 （ DNA 聚合酶） 0． 5 μL， 10 × Pfu buffer 3 μL， 4 × dNTP 擴增的 30 μL 反應體系： DNA 模板 0． 3 μL， 2． 4 μL，上下游引物各1． 5 μL， ddH2 O 加至30 μL。PCＲ 擴增條件為： 94 ℃ 預變性 2 min，94 ℃ 變性
［14 ］ 30 s，55 ℃ 退火 30 s， 72 ℃ 延伸 2 min， 共 30 個循環(huán) ； 最后以 72 ℃ 延伸 10 min 結束。擴增的 PCＲ 產(chǎn) 物在1． 0% 的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離后 ，用 DNA 純化試劑盒回收目的 DNA 片段。

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分析化學

第 42 卷

將純化后得到的 DNA 進行基因序列測定（ 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司） 。采用 Mega 5． 0 的軟件 ［ 15 ］ J 法（ 連接近鄰法） 構建系統(tǒng)進化樹， 對多序列比對結果進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析， 用 N鑒定細菌的種類 。

3
3． 1

結果與討論

阿魏酸代謝物的鑒定 QTOF / MS 采集的 MS 數(shù)據(jù)進行處理， 采用 Metabolynx 軟件將 UPLC該軟件以質(zhì)量丟失濾過（ MDF） TM 處理為基礎， 用于復雜生物基質(zhì)中快速檢測藥物代謝物 。經(jīng) Metabolynx 軟件處理后， 檢測到的經(jīng)人體
表 1 阿魏酸原型及其 3 種代謝產(chǎn)物的保留時間 、 分子式、 離子碎片等信息 Table 1 UPLC / ESIMS， retention time （ ＲT） and fragment ions of ferulic acid and its metabolites
序號 No． M0 M1 M2 M3 保留時間 ＲT（ min） 3． 20 3． 09 2． 89 5． 73 分子式 Formula C10 H10 O4 C10 H12 O4 C 9 H8 O 4 C 9 H8 O 3 二級質(zhì)譜碎片 MS / MS 193 ， 178 ， 163 ， 149 ， 135 195 ， 151 ， 135 ， 121 179 ， 135 ， 119 163 ， 147 ， 119 ， 103 鑒定 Identification 原型 Parent 氫化的阿魏酸 Hydrogenated FA 咖啡酸 Caffeic acid 去甲氧基化的阿魏酸 Demethoxylated FA 細菌 Strain sp． 45 / sp． 46 sp． 45 sp． 46 sp． 46

腸道細菌作用后的阿魏酸的代謝產(chǎn)物見表 1 。

3． 1． 1

! 46 號細菌的樣品中存在準分子離子峰［ M － H］ （ m / z 193 ） 的化合物 M0 原形化合物 M0 在 45、 ! ! ! （ t Ｒ = 3． 20 min ） ， M － CH3 ］ （ m / z 178） 、［ M － CH2 O］ （ m / z 163） 、［ M － CO2 ］ 在 二 級 質(zhì) 譜 中 有［

! （ m / z 149） 、［ M － CO2 － CH3］ （ m / z 134） 等主要碎片離子峰， 與阿魏酸對照品相同， 由此確定為阿魏酸。 3． 1． 2 氫化產(chǎn)物 M1 在 45 號樣品的一級全掃描質(zhì)譜中， 代謝產(chǎn)物 M1 （ t Ｒ = 3． 09min） 的準分子離子峰 ! ! M － H］ （ m / z 195 ） ， M － H］ （ m / z 193 ） ， 為［ 阿魏酸的準分子離子為［ 說明 M1 可能為阿魏酸的氫化還原 ! ! M + H2］ （ m / z 195） 、［ M + H2 － CO2］ （ m / z 151） 、［ M + H2 － 產(chǎn)物。對 M1 進行二級質(zhì)譜分析， 主要有［ ! ! （ m / z 135） 、［ M + H2 － CO2 － CH2 O］ （ m / z 121 ） 等碎片離子峰， CO2 － O］ 其質(zhì)譜斷裂特征規(guī)律與阿魏 ， 。 酸相似 故推測發(fā)生了氫化反應

3． 1． 3

去甲基產(chǎn)物 M2 在 46 號樣品的一級全掃描質(zhì)譜中， 代謝產(chǎn)物 M2 （ t Ｒ = 2． 89 min ） 的準分子離子

! M － H］ （ m / z 179 ） ， 推測由阿魏酸結構中脫去一分子甲基而形成。 對 M2 進行二級質(zhì)譜分析， 其 峰為［ ! ! M － CO2］ （ m / z 135） 、［ M － CO2 － O］ （ m / z 119 ） ， 主要碎片離子峰有 ［ 由此推斷 M2 為阿魏酸經(jīng) 46 號

細菌作用后的去甲基化產(chǎn)物。 3． 1． 4 去甲氧基產(chǎn)物 M3 在 46 號樣品的一級全掃描質(zhì)譜中， 代謝產(chǎn)物 M3 （ t Ｒ = 5． 73min） 的準分子離
! ! M － H］ （ m / z 163 ） ， M － H］ （ m / z 193 ） ， 阿魏酸的準分子離子為［ 推測 M3 可能為阿魏酸的去甲 子峰為［ ! ! 。 M3 ［ M － O ］ （ m / z 147 ） ，［ M － CO2］ （ m / z 119） ，［ M － CO2 氧基化產(chǎn)物 對 進行二級質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)有 ! － O］ （ m / z 103 ） 等主要碎片離子峰， 故推測 M3 是阿魏酸的去甲氧基化產(chǎn)物。 上述各代謝物在 45 號和 46 號細菌孵育樣品的液相色譜圖如圖 1 ， 各成分的二級質(zhì)譜如圖 2 。

圖1 Fig． 1

阿魏酸及其代謝產(chǎn)物的色譜圖 ： （ a） 為 45 號細菌孵育液的色譜圖 ，（ b） 為 46 號細菌孵育液的色譜圖 UPLC / MS chromatograms of ferulic acid and its metabolites，（ a） strain 45 sample，（ b） strain 46 sample

3． 2

對阿魏酸有特殊代謝能力細菌的鑒定 對 阿魏酸有較強代謝能力的45 號細菌的基因登錄號為 KC41732 ， 此細菌的基因進化樹如圖3 ， 經(jīng)

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張 蔚等： 腸道細菌對阿魏酸的代謝研究

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圖2 Fig． 2

阿魏酸及其代謝物的二級質(zhì)譜裂解圖 ： （ a） M0 （ m / z 193 ） ，（ b） M1 （ m / z 195 ） ，（ c ） M2 （ m / z 179 ） ， UPLCMS / MS spectra of ferulic acid and its metabolites： （ a ） M0 （ m / z 193 ） ，（ b ） M1 （ m / z 195 ） ，

（ d） M3 （ m / z 163 ） （ c） M2 （ m / z 179 ） ，（ d） M3 （ m / z 163 ）

圖3 Fig． 3

45 號細菌的基因進化樹 Phylogenetic tree of bacteria sp． 45

鑒定為 Enterococcus sp． 45 。 本實驗通過體外糞便溫孵法及超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜手段檢測到了阿魏酸經(jīng)人體腸 道細菌作用后的 3 個代謝產(chǎn)物。結果表明， 阿魏酸在不同種的細菌作用下會發(fā)生不同類型的代謝轉(zhuǎn)化 ， 推測可能與細菌生長過程中產(chǎn)生的多種不同種類的代謝酶有關 。本研究還通過 16S rＲNA 技術鑒定了 結果表明， 細菌 sp． 45 的同源性與腸球菌屬最為接 一株可將阿魏酸特異性的轉(zhuǎn)化為其氫化產(chǎn)物的細菌 ， 近， 故將其命名為 Enterococcus sp． 45 。 本研究結果提示 Enterococcus sp． 45 會產(chǎn)生氫化還原酶，Bacillus sp． 46 會產(chǎn)生脫甲基酶和脫甲氧基酶。綜上， 本研究為全面了解腸道細菌對阿魏酸的代謝提供了依據(jù)， 也為活性代謝物的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)業(yè)化奠定基礎 。本方法還可用于其它多種復雜化合物的細菌代謝分析 。

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第 42 卷

Ｒeferences
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Study on Metabolism of Ferulic Acid Produced by Intestinal Bacteria
ZHANG Wei，JIANG Shu，QIAN DaWei * ，SHANG ErXin，GUAN HanLiang，ＲEN Hao，DUAN JinAo （ Jiangsu Key Laboratory for High Technology Ｒesearch of Traditional Chinese Medicine Formulae， Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Ｒesources Industrialization， Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046 ，China）

Abstract

The investigation on the metabolism of ferulic acid by incubating ferulic acid with different isolated

bacteria from human feces in vitro was carried out． Fresh human fecal sample was obtained from a healthy volunteer， diluted serially in sterile water and sixtynine different bacterial colonies were picked out ultimately． Ultra performance liquid chromatographyquadrupole timeofflight mass spectrometry （ UPLCQTOF / MS） with automated data analysis software （ MetaboLynx TM ） was applied to fast analysis of ferulic acid metabolites． The results indicated that hydrogenation，demethylation and demethoxylation were the major metabolic pathways of ferulic acid by human intestinal bacteria in vitro． Two strain bacteria were found to metabolize ferulic acid and one of them had been identified as Bacillus sp． 46． The 16S rＲNA gene of the other isolated bacterium sp． 45 was base pair sequences and its nucleotide sequence has registered in GenBank under accession no． KC41732． Finally，this strain was identified as Enterococcus sp． 45 by phylogenetic affiliation． This study suggested that intestinal bacteria had the metabolic effects of ferulic acid and the biotransformation was completed by different bacteria． Keywords Ferulic acid； Intestinal bacteria； Ultra performance liquid chromatographyquadrupole timeof（ Ｒeceived 20 June 2013 ； accepted 12 October 2013 ） This work was supported by the Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions of China （ No． 10KJA360039 ）

flight mass spectrometry； Metabolites； 16S Ｒrna



  本文關鍵詞：腸道細菌對阿魏酸的代謝研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。