發(fā)布時(shí)間：2017-11-14 01:17

  本文關(guān)鍵詞：姜黃素減緩橫擬微重力誘導(dǎo)的骨質(zhì)丟失機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的及研究背景微重力條件下,人體受力學(xué)環(huán)境的改變會(huì)引起人體多個(gè)系統(tǒng)、器官和組織發(fā)生顯著而持續(xù)的生理病理變化,而微重力誘發(fā)的骨質(zhì)丟失是其中非常突出的問(wèn)題之一。微重力引發(fā)的骨質(zhì)疏松增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn),限制了人類對(duì)太空的探索；而且微重力與長(zhǎng)期臥床制動(dòng)誘發(fā)的骨質(zhì)疏松,同屬?gòu)U用性骨質(zhì)疏松,病理機(jī)制非常相似。因此,研究微重力環(huán)境下誘發(fā)骨質(zhì)丟失的機(jī)制并找到相應(yīng)的對(duì)抗策略,對(duì)于宇航人員和長(zhǎng)期臥床的人群都具有非常重要的意義。目前,微重力誘發(fā)骨質(zhì)丟失的確切機(jī)制尚不清楚,現(xiàn)有的對(duì)抗方案也不理想。近些年,氧化應(yīng)激(Oxidative stress)在骨質(zhì)疏松病理機(jī)制中的作用引起廣泛關(guān)注。在雌激素水平下降和年齡增長(zhǎng)引發(fā)的骨質(zhì)疏松中,都發(fā)現(xiàn)活性氧自由基(ROS, Reactive oxygen species)在體內(nèi)大量蓄積,而且應(yīng)用抗氧化應(yīng)激藥物在防治上述兩種骨質(zhì)疏松方面也取得了不錯(cuò)的效果。近來(lái),學(xué)者們發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可能在微重力誘發(fā)的骨質(zhì)丟失方面也起到了非常重要的作用,并且通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)也取得了積極效果。因此,有必要尋找或開發(fā)具備抗氧化應(yīng)激的理想藥物,來(lái)防治微重力誘發(fā)的骨質(zhì)丟失。姜黃素(C21H20O6)是從姜黃的根莖中提取的一種天然酚醛樹脂,是一種天然抗氧化劑以及自由基清除劑。作為烹飪調(diào)味品,它已經(jīng)被東方民族廣泛應(yīng)用,還用于治療疾病,包括糖尿病、肝膽病變、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和胃腸病變等。近來(lái),姜黃素作為潛在的治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松藥物引起了科學(xué)家的關(guān)注。它可以改善絕經(jīng)后引起的骨質(zhì)疏松,以及牙周炎引起的骨質(zhì)丟失。另外,姜黃素可改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的骨纖維結(jié)構(gòu)和提高骨礦質(zhì)密度。有的報(bào)道認(rèn)為姜黃素是雙向抗氧化劑,它能夠直接與活性氧反應(yīng),誘導(dǎo)具有細(xì)胞保護(hù)作用和抗氧化作用的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。另外,姜黃素也能夠與維生素D受體結(jié)合(VDR),激活維生素D受體目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。而姜黃素能否緩解微重力條件下引發(fā)的骨質(zhì)丟失,還有待探討。目的1.研究姜黃素對(duì)于模擬微重條力件下成骨細(xì)胞代謝和分化等功能的影響,并探討其作用機(jī)制。2.研究姜黃素對(duì)于模擬微重條力件下破骨細(xì)胞生成和代謝的影響,并探討其作用機(jī)制。3.研究模擬微重力條件對(duì)于SD大鼠骨代謝的影響,探討姜黃素對(duì)于模擬微重力條件下SD大鼠骨質(zhì)丟失的影響及其作用機(jī)制。方法1.旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS, Rotary cell culture system)模擬體外微重力條件,體外培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞。根據(jù)不同處理方法將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為四組：(1)1G重力對(duì)照組(Con); (2) 1G重力+姜黃素對(duì)照組(Con+CUR,4μM);(3)模擬失重組(MG)；(4)模擬失重+姜黃素組(MG+CUR,4μM)。實(shí)驗(yàn)組加入姜黃素(4μM)共同模擬微重力條件下培養(yǎng)96h后,檢測(cè)細(xì)胞中ROS產(chǎn)量及培養(yǎng)液中OPG和RANKL含量；用pRT-PCR (Quantitative real-time PCR analysis)法結(jié)合Western Blot法檢測(cè)VDR的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組加入姜黃素(4gM)共同培養(yǎng)7天后,檢測(cè)ALP活力水平。然后綜合評(píng)估微重力條件對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及分化功能的影響,并探討姜黃素在其中發(fā)揮的作用及其機(jī)制。2.旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS, Rotary cell culture system)模擬體外微重力條件,體外培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞。根據(jù)不同處理方法將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為五組(1)1g重力組(Con)(2)模擬失重組(MG)；(3)模擬失重+1,25-二羥維生素D組(MG+1,25D,10nM); (4)模擬失重+姜黃素組(MG+curcumin,4 μM)(5)模擬失重+1,25-二羥維生素D+姜黃素組(MG+1,25D+curcumin,4 μM和10 nM)。同方法1,檢測(cè)ROS、ALP和RANKL/OPG,對(duì)比分析姜黃素與1,25D對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞代謝和分化的影響。3.旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS, Rotary cell culture system)模擬體外微重力條件,體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,利用RANKL (20ng/ml)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成。根據(jù)不同處理方法,將實(shí)驗(yàn)分為4組：(1)模擬失重組(MG組)；(2)模擬失重+姜黃素(4μM)組(MG+CUR組)；(3)1G重力對(duì)照組(Con組)；(4)1G重力+姜黃素對(duì)照組(Con+CUR組)。實(shí)驗(yàn)組加入姜黃素(4μM)共同培養(yǎng),TRAP染色后計(jì)算破骨細(xì)胞(≥3個(gè)細(xì)胞核)生成數(shù)目,檢測(cè)ROS水平,qRT-PCR法檢測(cè)Cath K和TRAP mRNA表達(dá)水平。分析微重力條件對(duì)RAW264.7細(xì)胞生成、代謝的影響,探討姜黃素在其中發(fā)揮的作用及其機(jī)制。4.SD大鼠吊尾模型模擬微重條件(Hind-limb suspension, HLS),經(jīng)口喂飼SD大鼠姜黃素(40mg/kg. Day)。根據(jù)不同處理方法將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為四組：(1)非吊尾對(duì)照組(Con)；(2)喂食姜黃素的非吊尾對(duì)照組(Con+CUR);(3)單純吊尾實(shí)驗(yàn)組(HLS)；(4)喂食姜黃素的吊尾實(shí)驗(yàn)組(HLS+CUR)。喂食6周后處死大鼠,經(jīng)腹主動(dòng)脈收集全血樣本,檢測(cè)血清維生素D (1,25-(OH)2D3),丙二醛(MDA)水平。5.同方法3模擬微重力處理SD大鼠6周后,收集尿液檢測(cè)尿液脫氧吡啶諾林(DPD),尿肌酸酐(CRE)水平。6.同方法3模擬微重力處理SD大鼠6周后,取大鼠左側(cè)股骨制備骨勻漿,檢測(cè)骨丙二醛(MDA)水平,總巰基水平(Total sulfhydryl, t-SH)。pRT-PCR (Quantitative real-time PCR analysis)法檢骨樣本的TRAP、OCN、RANKL、 OPG的mRNA表達(dá)水平。pRT-PCR結(jié)合Western Blot法檢測(cè)骨樣本中VDR的表達(dá)水平。7.同方法3模擬微重力處理SD大鼠6周后,切取左側(cè)脛骨,選取脛骨近端干骺端制備骨樣本,采用雙能X線吸收骨密度儀(DEXA)檢測(cè)骨密度。8.同方法3模擬微重力處理SD大鼠6周后,切取左側(cè)脛骨,選取脛骨近端干骺端制備骨樣本,經(jīng)脫水、Von Kossa法染色等步驟處理后,使用Bioquant骨組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)骨標(biāo)本進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)檢測(cè),檢測(cè)骨表面(Ob.S/BS)、破骨細(xì)胞面(Oc.S/BS)。9.同方法3模擬微重力處理SD大鼠6周后,切取左側(cè)脛骨,選取脛骨近端干骺端制備骨樣本,采用micro-CT進(jìn)行松質(zhì)骨骨小梁形態(tài)學(xué)檢測(cè),檢測(cè)參數(shù)包括骨小梁容積率(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb. Th)、骨小梁間隔(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)。10.同方法3模擬微重力處理SD大鼠6周后,制備左側(cè)股骨樣本,使用材料測(cè)試分析儀進(jìn)行股骨靜力三點(diǎn)彎曲試驗(yàn),檢測(cè)極限載荷(Ultimate load)、硬度(Stiffoess)和最大吸收能(Energy absorbtion)生物力學(xué)參數(shù)。結(jié)果1.MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con),模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)液中ROS含量升高了48.2%(p=0.002),而模擬微重力+姜黃素組(MG+CUR)與單純模擬微重力組(MG)組相比ROS水平下降了26.6%(p=0.014)。2. MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于相比于正常重力組(Con),模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)液中OPG產(chǎn)量下降了17.5%(p0.001),而MG+CUR組與MG組相比OPG產(chǎn)量升高了19.9%(p0.001)；相比于正常重力組(Con),模擬微重力組(MG)組RANKL產(chǎn)量明顯增加(p0.001), RANKL/OPG比值顯著升高(p0.001)；而MG+CUR組與單純模擬微重力組(MG)組相比RANKL產(chǎn)量明顯下降(P0.05),相比于單純模擬微重力組(MG)組,MG+CUR組RANKL/OPG比值明顯下降(p0.001)。3. MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con),模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細(xì)胞的VDRmRNA表達(dá)水平下降了68%(p0.001)和蛋白表達(dá)水平下降了72%(p0.001)；而MG+CUR組與單純模擬微重力組(MG)組相比,VDRmRNA(p0.001)表達(dá)水平升高了194%而蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高了168%(p0.001)。4. MC3T3-E1細(xì)胞在RWVB中孵育養(yǎng)7天后,ALP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con),模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性明顯降低(p=0.005),而模擬微重力+姜黃素組(MG+CUR)組與單純模擬微重力組(MG)組相比ALP活性明顯升高(p=0.020)。5.同方法1處理MC3T3-E1細(xì)胞后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于Con組,MG組MC3T3-E1細(xì)胞ROS水平顯著升高(p=0.001),MG組與MG+1,25D組相比無(wú)明顯差異(p=0.54)；而MG+CUR組和MG+1,25D+CUR組與MG組相比ROS水平顯著下降(p=0.006；p=0.001)。而MG+CUR組與MG+1525D+CUR組相比無(wú)明顯差異(p=0.74)。6.同方法1處理MC3T3-E1細(xì)胞后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con),模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)液中RANKL/OPG值顯著升高(p=0.007)；而MG+CUR組、MG+1,25D+CUR組和MG+1,25D與模擬微重力組(MG)相比RANKL/OPG值均顯著下降(p=0.01; p=0.009; p=0.005)o MG+CUR組與MG+1,25D相比無(wú)明顯差異(p=0.55)；MG+CUR組與MG+1,25D+CUR組相比亦無(wú)明顯差異(p=0.44)。7.同方法1處理MC3T3-E1細(xì)胞后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con),模擬微重力組(MG)MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性明顯降低(p=0.04),而MG+CUR組、MG+1,25D+CUR組和MG+1,25D與模擬微重力組(MG)相比ALP活性均明顯升高(p=0.07; p=0.009; p=0.13)o MG+CUR組與MG+1,25D相比無(wú)明顯差異(p=0.85)；MG+CUR組與MG+1,25D+CUR組相比亦無(wú)明顯差異(p=0.54)。8. RAW254.7細(xì)胞在RWVB中孵育96 hours后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con),模擬微重力組(MG)RAW254.7細(xì)胞的ROS產(chǎn)量增加160%(p0.001),而模擬微重力+姜黃素組(MG+CUR)組與單純模擬微重力組(MG)組相比ROS水平下降39.3%(P0.05)。9. RAW254.7細(xì)胞在RWVB中孵育96 hours后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con),模擬微重力組(MG)RAW254.7細(xì)胞的CathK和TRAPraRNA表達(dá)水平升高明顯(p0.001),而模擬微重力+姜黃素組(MG+CUR)組與單純模擬微重力組(MG)組相比CathK和TRAPmRNA表達(dá)水平明顯降低MG組(p0.001)。10. TRAP染色陽(yáng)性的多核破骨細(xì)胞數(shù)目,模擬微重力組(MG)明顯高于正常重力組(Con)(3nuclei30, p0.001; nuclei30, p0.001),而MG+CUR組TRAP染色陽(yáng)性性的多核破骨細(xì)胞數(shù)目明顯低于模擬微重力組(MG)(3nuclei30, p=0.001; nuclei30, p0.001)。11.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)尾吊組(HLS)比目魚肌/體重比值下降明顯(p0.001)；相比于正常重力組(Con),尾吊組(HLS)引起SD大鼠,食物攝入量下降(p=0.010),體重也顯著下降(p0.001)。12.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con),尾吊組(HLS)大鼠脛骨BMD下降明顯(p=0.011)；而HLS+CUR組與尾吊組(HLS)相比大鼠脛骨BMD明顯升高(p=0.032)。13.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,Micro-CT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)尾吊組(HLS)大鼠脛骨近端骨松質(zhì)骨小梁厚度(Tb. Th, trabecular thickness) (p=0.002),骨小梁數(shù)量(Tb. N, trabecular number) (p=0.002)、和骨樣本骨容積分?jǐn)?shù)(Bone volume fraction, Total volume, BV/TV) (p0.001)均明顯下降,而骨小梁間距(Tb.Sp, trabecular separation)明顯升高(p0.001)；而尾吊+姜黃素組(HLS+CUR)與尾吊組(HLS)相比Tb.Th(p=0.013)、Tb.N(p=0.018)和BV/TV(p=0.008)明顯升高,而Tb.Sp下降明顯(p0.001)。14.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,骨組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HLS組脛骨近端骨樣本中活躍成骨細(xì)胞表面(Ob. S/BS)顯著降低(p0.001),而破骨細(xì)胞表面(OC.S/BS)明顯升高；而HLS+CUR與HLS相比Ob. S/BS顯著升高,而OC. S/BS下降明顯(p0.001)。15.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,生物力學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HLS組股骨干極限載荷(Ultimate load) (p=0.007),硬度(Stiffness) (p0.001),最大吸收能(Energy absorbtion) (p=0.004)均顯著降低；而與HLS相比,HLS+CUR組,極限載荷(p=0.027),硬度(p=0.015),最大吸收能(p=0.021)均明顯升高。16.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,股骨樣本qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con),尾吊組(HLS)大鼠股骨樣本TRAP mRNA表達(dá)水平明顯升高(p0.001);而與HLS組相比.HLS+CUR組TRAP表達(dá)水平下降明顯(P0.05)；尾吊組(HLS)骨鈣蛋白(OCN, osteocalcin) mRNA表達(dá)水平表達(dá)水平顯著降低(p0.001),而與HLS組相比,HLS+CUR組OCN mRNA表達(dá)水平升高明顯(P0.05)。相比于Con組,RANKL/OPG mRNA比值,HLS組顯著升高(p0.001),而HLS+CUR組RANKL/OPG mRNA表達(dá)水平比值下降(p0.001)。17.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,股骨樣本qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HLS組較Con組VDR的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降(p0.001；(p0.001),而HLS+CUR組與HLS組相比VDRmRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(p0.001；p0.001)。18.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與Con組相比,HLS組和CUR+HLS組血漿1,25-(OH)2D3水平均顯著下降(P=0.01；P=0.02)；而HLS組與CUR+HLS相比無(wú)明顯差異(P=0.55)。19.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,HLS組大鼠尿液中尿脫氧吡啶諾林(Deoxypyridinoline, DPD)相比Con組顯著升高(p0.001),而與HLS組相比,HLS+CUR組尿中DPD水平值下降明顯(p=0.003)。20.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,相比于Con組,股骨樣本總巰基(t-SH)水平顯著下降(p=0.002)；而HLS+CUR組與HLS組相比,骨樣本t-SH水平顯著升高(p0.001)。21.SD大鼠吊尾實(shí)驗(yàn)6周后,相比于Con組,HLS組大鼠血漿丙二醛(MDA)水平和股骨樣本丙二醛(MDA)水平均明顯升高(p=0.003；p=0.006)；而HLS +CUR組與HLS組相比,血漿MDA水平和骨樣本MDA水平均顯著下降(p=0.011；p=0.017)。結(jié)論1.模擬微重力使MC3T3-E1細(xì)胞ROS水平升高,抑制細(xì)胞的增殖分化能力；而姜黃素能夠明顯減弱模擬微重力對(duì)MC3T3-E1的抑制作用,降低ROS水平,上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞VDR表達(dá)水平。2.模擬微重力條件使RAW254.7細(xì)胞ROS水平升高,有利于破骨細(xì)胞生成,并使破骨細(xì)胞活力增強(qiáng),而姜黃素能夠明顯抑制破骨細(xì)胞的生成,降低破骨細(xì)胞的活力。3、吊尾微重力(HLS)使大鼠骨吸收與骨生成失偶聯(lián),骨質(zhì)丟失明顯,而姜黃素能明顯減緩模擬微重引發(fā)的骨質(zhì)丟失,其機(jī)制可能與其抑制ROS和上調(diào)VDR表達(dá)水平有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R85
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本文編號(hào)：1183224