本文關(guān)鍵詞：用熒光強度反映Cbfa1活性成骨細(xì)胞模型的構(gòu)建及其應(yīng)用研究

  更多相關(guān)文章： 模擬微重力效應(yīng) 成骨細(xì)胞分化 Cbfa1 熒光強度 PI3K信號通路

【摘要】： 在中長期太空飛行中,空間骨丟失對航天員健康的影響是目前航天醫(yī)學(xué)關(guān)注的重點之一。研究表明,微重力條件下,成骨細(xì)胞分化功能降低,骨形成減少,特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1在此過程中起關(guān)鍵作用。研究重力因素對Cbfa1活性調(diào)節(jié)機制對于闡明空間骨丟失機理非常重要。 本研究以未分化的人成骨瘤細(xì)胞MG63為對象,利用回轉(zhuǎn)器模擬微重力效應(yīng)和細(xì)胞離心機實現(xiàn)超重,采用基因?qū)�、信號途徑干預(yù)劑處理等細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù),研究不同重力因素對成骨細(xì)胞分化的影響,探討重力因素對Cbfa1活性及成骨向分化、以及PI3K信號通路的影響;以期為空間骨丟失機理和對抗防護研究提供科學(xué)依據(jù)。主要獲得以下研究結(jié)果: 1、合成了以6個Cbfa1結(jié)合元件為主要調(diào)控元件的miniOC啟動子,并構(gòu)建由該啟動子驅(qū)動的EGFP報告基因真核表達載體,轉(zhuǎn)染并篩選獲得OSE-MG63成骨細(xì)胞模型,細(xì)胞的熒光強度能夠反映Cbfa1的活性,為航天細(xì)胞搭載實驗提供一種更為方便有效的研究模型。 2、模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)MG63細(xì)胞ERK1/2、p38、p85蛋白表達量均低于對照組(1G),并且隨回轉(zhuǎn)時間增加其抑制作用持續(xù),表明微重力影響成骨細(xì)胞增殖分化的MAPK、PI3K信號途徑。模擬微重力效應(yīng)顯著抑制PI3K的p85蛋白磷酸化水平,并且下調(diào)了Cbfa1的表達;相反,超重效應(yīng)能夠提高p85蛋白磷酸化水平,上調(diào)了Cbfa1的表達。 3、以構(gòu)建OSE-MG63細(xì)胞模型為對象,采用不同重力條件與PI3K信號通路的阻斷劑(LY294002)和激活劑(IGF-I)復(fù)合處理,結(jié)果顯示:模擬微重力顯著抑制OSE-MG63細(xì)胞的熒光強度,而超重則提高其熒光強度;IGF-I能夠誘導(dǎo)Cbfa1活性提高,但由IGF-I誘導(dǎo)的熒光強度升高作用受到LY294002的顯著抑制。表明模擬微重力減弱IGF-I的成骨作用,超重提高Cbfa1活性是通過PI3K信號通路。
【關(guān)鍵詞】：模擬微重力效應(yīng) 成骨細(xì)胞分化 Cbfa1 熒光強度 PI3K信號通路
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R85
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 第一章 綜述8-21
• 1.1 空間骨丟失現(xiàn)象8-11
• 1.1.1 正常重力下的骨代謝9
• 1.1.2 成骨細(xì)胞的分化過程9-10
• 1.1.3 微重力對成骨細(xì)胞分化的影響10-11
• 1.2 骨向分化特異性轉(zhuǎn)錄因子CBFA111-14
• 1.2.1 Cbfa1 概況11-13
• 1.2.2 Cbfa1 的功能13-14
• 1.2.3 微重力對Cbfa1 的影響14
• 1.3 信號通路對CBFA1 的表達與活性影響14-18
• 1.3.1 Cbfa1 的表達及活性調(diào)節(jié)14-15
• 1.3.2 多種信號通路聚焦于Cbfa115-16
• 1.3.3 P13K-Akt 信號通路在成骨細(xì)胞分化中的作用16-17
• 1.3.4 微重力影響P13K-Akt 信號通路17-18
• 1.4 微重力下骨代謝的研究方法18-19
• 1.4.1 微重力模擬方法及其應(yīng)用18-19
• 1.4.2 實時報告基因——綠色熒光蛋白GFP19
• 1.5 本研究的目的與意義19-21
• 第二章 構(gòu)建用熒光強度反映CBFA1 活性的成骨細(xì)胞模型21-34
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 主要儀器21-22
• 2.1.2 試劑及其配制22-23
• 2.2 實驗方法23-28
• 2.2.1 6OSE2 基因啟動子擴增23-24
• 2.2.2 p6OSE2-EGFP 表達載體構(gòu)建24-26
• 2.2.3 MG63 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代的方法26
• 2.2.4 G418 最小致死濃度確定26
• 2.2.5 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染MG63 細(xì)胞26-27
• 2.2.6 OSE-MG63 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選27
• 2.2.7 OSE-EGFP 穩(wěn)定細(xì)胞株熒光強度分析27
• 2.2.8 細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶ALP 染色方法（改良Gomori 法）27-28
• 2.2.9 細(xì)胞培養(yǎng)液堿性磷酸酶ALP 活性測定方法28
• 2.3 結(jié)果與分析28-32
• 2.3.1 6OSE2 基因啟動子擴增28-29
• 2.3.2 表達載體的鑒定結(jié)果29
• 2.3.3 G418 最小致死濃度的確定29
• 2.3.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染6OSE2-EGFP 基因細(xì)胞株的篩選29-30
• 2.3.5 OSE-MG63 細(xì)胞株對骨向誘導(dǎo)劑的響應(yīng)30-32
• 2.4 討論32-34
• 第三章 不同重力條件對CBFA1 活性及信號通路的影響34-46
• 3.1 材料34-36
• 3.1.1 主要儀器34-35
• 3.1.2 主要試劑35-36
• 3.2 方法36-40
• 3.2.1 MG63 細(xì)胞在回轉(zhuǎn)模擬微重力下的培養(yǎng)方法36
• 3.2.2 MG63 細(xì)胞在超重條件下的培養(yǎng)方法36-37
• 3.2.3 靜止條件下加入P13K 激活劑及抑制劑培養(yǎng)MG63 的方法37
• 3.2.4 模擬微重力環(huán)境下加入P13K 激活劑培養(yǎng)OSE-MG63 的方法37
• 3.2.5 超重環(huán)境下加入P13K 抑制劑培養(yǎng)OSE-MG63 的方法37-38
• 3.2.6 細(xì)胞裂解及總蛋白提取38
• 3.2.7 細(xì)胞總蛋白濃度測定38-39
• 3.2.8 Western-Blot 檢測信號分子蛋白表達39-40
• 3.2.9 OSE-MG63 細(xì)胞熒光強度分析方法（如2.3.7）40
• 3.2.10 細(xì)胞內(nèi)ALP 染色方法（如2.3.8）40
• 3.3 結(jié)果與分析40-44
• 3.3.1 模擬微重力環(huán)境下p38、Erk1/2 和p85 蛋白表達變化40
• 3.3.2 不同重力環(huán)境對p85 及Cbfa1 蛋白表達的影響40-41
• 3.3.3 IGF-I 對p85 蛋白表達及磷酸化的影響41
• 3.3.4 模擬微重力環(huán)境下P13K 激活劑對Cbfa1 活性及骨向分化的影響41-42
• 3.3.5 超重環(huán)境下P13K 抑制劑對Cbfa1 活性及骨向分化的影響42-44
• 3.4 討論44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻47-53
• 附錄53-56
• 致謝56-57
• 作者簡介57

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