本文關(guān)鍵詞：一種基于ELISA檢測氮芥誘導(dǎo)的MGMT-DNA交聯(lián)體的方法

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【摘要】：目的建立一種基于酶聯(lián)免疫吸附法檢測O6-烷基轉(zhuǎn)移酶(O6-Methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)與DNA的交聯(lián)體(MGMT-DNA crosslink,M-DPC)含量的簡便方法。方法整合當(dāng)前技術(shù)提取及純化M-DPC、定量M-DPC樣品中ds DNA含量、優(yōu)化DPC中抗原在ELISA板的包被能力等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以不同濃度氮芥處理人支氣管上皮細(xì)胞HBE,在指定的時(shí)間收集細(xì)胞,使用細(xì)胞核抽提/裂解/Tris飽和酚回收法制備M-DPC樣品。采用SYBR GreenⅠ染色方法對(duì)M-DPC樣品中ds DNA進(jìn)行定量。采用全能核酸酶對(duì)M-DPC樣品中脫氧核糖核酸降解,以增強(qiáng)M-DPC樣品中抗原在ELISA板的包被能力。最終,包被后的多孔板檢測采用常規(guī)的ELISA。結(jié)果無需高速離心機(jī)和放射性同位素等,使用常規(guī)方法提取了細(xì)胞M-DPC。SYBR GreenⅠ檢測基因組ds DNA的線性范圍為2 ng至1.5μg,可以用于提取的M-DPC所含ds DNA的定量,據(jù)此統(tǒng)一樣本用量。M-DPC可以通過ELISA檢出,且在一定范圍內(nèi)有線性關(guān)系。氮芥染毒3 h后M-DPC含量有顯著增加,且對(duì)氮芥劑量有依賴。至24 h M-DPC含量無顯著降低。結(jié)論所建立的ELISA檢測M-DPC的方法快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏、高通量,也可應(yīng)用于部分其他交聯(lián)蛋白的檢測。氮芥染毒所致M-DPC形成有時(shí)間和劑量效應(yīng)。
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所;
【關(guān)鍵詞】： MGMT-DNA交聯(lián)物 ELISA SYBR GreenⅠ 氮芥
【基金】：國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81302862,81502711) 全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”重大項(xiàng)目(AWS11C004)~~
【分類號(hào)】：R82
【正文快照】： content was increased significantly in 3 h after nitrogen mustard treatment in a dose-dependent manner,andwas maintained at a high level till 24 h.Conclusion Our method to detect M-DPC by ELISA is easy,rapid,sensitive,and high throughput,and may also be

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本文編號(hào)：1062388